In this thesis, the mechanism of protein aggregation and the interactions of aggregating proteins with molecular chaperones are investigated using solution and solid-state NMR spectroscopy. The influence of chaperones on the protein aggregation is studied for the two systems, Sup35/Hsp104 and Abeta(1-40)/alphaB-crystallin. Protein aggregation itself is investigated using the model systems Abeta(1-40) and PI3-SH3. The yeast prion system (Sup35/Hsp104) was investigated using various NMR (Diffusion, Saturation Transfer Difference, etc.) and biophysical techniques (Equilibrium dialysis, CD spectroscopy, etc.). We could show that Hsp104 specifically interacts with critical oligomers of Sup35 and that this interaction modulates the aggregation characteristics. In the literature it has been shown that the interaction of the Alzheimer’s disease causing amyloid peptide (Abeta(1-40)) with a small heat shock protein, alphaB-crystallin, increases the neurotoxicity in cultured neurons. We could identify the chemical groups of Abeta(1-40) that are involved in this interaction using STD NMR. As a consequence of the interaction, we found that Met35 in Abeta(1-40) becomes oxidized. The reason for the increased neurotoxicity is discussed based on these findings. Using biochemical, NMR and biophysical approaches (Isothermal titration calorimetry, CD spectroscopy and Colorimetric and a NMR redox assay that developed during this thesis), we could characterize specific redox properties of Abeta(1-40) and alphaB-crystallin. We could show that the interaction of alphaB-crystallin with Abeta(1-40) is copper modulated and redox driven. A simple concept for the implication with respect to neurotoxicity is presented. For the two chaperone systems, we observe a general trend for ligand chaperone interactions, which involves redox activity of chaperones. This is discussed at the end of the thesis. The molecular mechanism of early steps in fibril formation is studied using the Abeta(1-40) peptide. Upon variation of the salt conditions, different oligomeric states of Abeta(1-40) could be generated that are analyzed by solution-state NMR experiments. We find that, in addition to specific peptide-peptide contacts, interactions of anions with selective amino acids of Abeta(1-40) are key for the aggregation process. The SH3 domain of phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3-SH3) forms amyloid fibrils when incubated at low pH for long periods of time. Early stages of fibril formation were studied using solution-state NMR, whereas the fibril structure was probed by solid-state NMR. By solid-state NMR, we find that the side chain of H25 is involved in fibril stabilizing interactions. By solution-state NMR , we show that modification of PI3-SH3 using Diethyl pyrocarbonate (DEPC) has an influence on the distribution of soluble and oligomeric PI3-SH3. Even though that the modified protein is more stable, aggregation is facilitated. Amino acids which specifically affected as a function of pH are identified using 1H, 15N correlation experiments. Structural models for protein aggregation are discussed in the context of domain swapping of SH3 domains.     «

In this thesis, the mechanism of protein aggregation and the interactions of aggregating proteins with molecular chaperones are investigated using solution and solid-state NMR spectroscopy. The influence of chaperones on the protein aggregation is studied for the two systems, Sup35/Hsp104 and Abeta(1-40)/alphaB-crystallin. Protein aggregation itself is investigated using the model systems Abeta(1-40) and PI3-SH3. The yeast prion system (Sup35/Hsp104) was investigated using various NMR (Diffusion...     »

In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Proteinaggregation und die Interaktionen zwischen aggregierenden Proteinen und Chaperonen mittels flüssigphasen und Festkörper-NMR Spektroskopie untersucht. Der Einfluss von Chaperonen auf die Proteinaggregation wurde in zwei Systemen untersucht, Sup35/Hsp104 und Abeta(1-40)/alphaB-Crystallin. Die Proteinaggregation selbst wurde an den Modellsystemen Abeta(1-40) und PI3-SH3 studiert. Das Hefe-Prion System (Sup35/Hsp104) wurde durch verschiedene NMR (Diffusion, Saturation Transfer Difference, etc.) und biophysikalische Methoden (Equilibrium dialysis, CD spectroscopy, etc.) untersucht. Wir konnten zeigen, dass Hsp104 spezifisch mit dem kritischen Oligomeren von Sup35 interagiert und diese Interaktion die Aggregationseigenschaften moduliert. In der Literatur wurde gezeigt, dass die Interaktion vom Morbus Alzheimer verursachenden Amyloidpeptid (Abeta(1-40)) mit dem kleinen Hitzeschockprotein alphaB-Crystallin, die Neurotoxizität in Neuronen erhöht. Wir konnten die chemischen Gruppen von Abeta(1-40), welche an der Interaktion beteiligt sind, durch STD-NMR identifizieren. Als Konsequenz dieser Interaktion wird Met35 in Abeta(1-40) oxidiert. Die Gründe für die erhöhte Neurotoxizität wurden auf der Grundlage dieser Ergebnisse diskutiert. Durch biochemische, NMR und biophysikalische Ansätze (Isothermale Titrations-Kalorimetrie, CD-Spektroskopie, colorimetrische Redoxpotentialmessung und einem in dieser Arbeit entwickelten auf NMR beruhender Redoxpotentialbestimmung), konnten wir die spezifischen Redox Eigenschaften von Abeta(1-40) und alphaB-Crystallin charakterisieren. Wir konnten zeigen, dass die Interaktion von alphaB-Crystallin mit Abeta(1-40) durch Kupfer moduliert ist und durch Redoxprozesse angetrieben wird. Ein einfaches Konzept in Verknüpfung zur Neurotoxizität wird vorgestellt. In beiden Chaperonesystemen konnten wir einen allgemeinen Trend zur Liganden-Chaperone-Interaktion beobachten, in welchem Redoxaktivität von Chaperonen beteiligt ist. Dies wird am Ende der Arbeit diskutiert. Der molekulare Mechanismus der frühen Fibrillenbildung wurde durch die Verwendung von Abeta(1-40) untersucht. Durch die Variation der Salzbedinungen konnten verschiedene oligomere Stufen von Abeta(1-40) für die flüssigkeits-NMR-Experimente generiert werden. Wir fanden, dass zusätzlich zu den spezifischen Peptid-Peptid Kontakten, Interaktionen von Anionen mit selektiven Aminosäurenfunktionen von Abeta(1-40) der Schlüssel für den Aggregationsprozess sind. Die SH3 Domäne von Phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3-SH3) bildet bei längerer Inkubation bei niedrigen pH-Werten amyloide Fibrillen. Die frühen Phasen der Fibrillenbildung wurden durch Flüssigphasen NMR Spektroskopie untersucht, wohingegen die Fibrillenstruktur mittels Festkörper NMR studiert wurde. Wir fanden, dass die Seitenkette von H25 an fibrillenstabilisierenden Interaktionen beteiligt ist. Mittels lösungs-NMR konnten wir zeigen, dass eine Modifikation von PI3-SH3 durch Diethyl- pyrocarbonate (DEPC) einen Einfluss auf die Verteilung von löslischen und oligomeren PI3-SH3 hat. Trotz der Tatsache, dass das modifizierte Protein stabiler ist, verlaüft die Aggregation schneller. Aminosäuren, welche spezifisch als Funktion des pH-Werts eine chemische Verschiebungsänderung zeigen, wurden durch 1H, 15N - Korrelations Experimente identifiziert. Strukturmodelle für die Proteinaggregation wurden im Kontext des Domänentauschs von SH3-Domänen diskutiert.     «

In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Proteinaggregation und die Interaktionen zwischen aggregierenden Proteinen und Chaperonen mittels flüssigphasen und Festkörper-NMR Spektroskopie untersucht. Der Einfluss von Chaperonen auf die Proteinaggregation wurde in zwei Systemen untersucht, Sup35/Hsp104 und Abeta(1-40)/alphaB-Crystallin. Die Proteinaggregation selbst wurde an den Modellsystemen Abeta(1-40) und PI3-SH3 studiert. Das Hefe-Prion System (Sup35/Hsp104) wurde durch verschiedene NMR (Dif...     »