Gene expression is a highly regulated process in our eukaryotic cells. To accomplish tight and dynamic control, regulatory functions affect protein production at various stages. The structural and biochemical work presented in this doctoral thesis, focuses on proteins involved in pre-mRNA splicing, one of the key steps in mRNA maturation, as well as on proteins engaged in chromatin remodeling. Notably, post-translational modifications, such methylation of arginine or lysine residues, have been shown to play critical roles for these processes. Chapter 1 and 2 serves as an introduction to regulation of gene expression and to structural biology, respectively. The aim is to give an overview of the current knowledge of the fundamental regulatory processes on the way from genes to proteins. The intention is to stress molecular aspects, and to point out how different pathways are intricately interconnected. Structural biology consists of rather different and complementary techniques. Here, mainly basic aspects of nuclear magnetic resonance (NMR), and its use to study the structure, dynamics and interactions of biomolecules, are covered. Chapter 3 describes the three-dimensional structure of the so-called TSN domain of Tudor-SN, comprising an extended Tudor domain fold. The structure was determined by X-ray crystallography. NMR 15N relaxation data and residual dipolar coupling measurements show that TSN adopts a compact fold, and that the two subdomains tumble together in solution, consistent with the crystal structure. Using NMR titrations, the TSN domain was found to bind peptides containing symmetrically dimethylated arginines (sDMA). The interaction involves an aromatic cage of the Tudor domain. Dimethylarginine-modified proteins have important functions in various cellular pathways, including the spliceosome. My results suggest how Tudor-SN might interact with the spliceosome, where it has been reported to enhance assembly and splicing efficiency. Chapter 4 reports the NMR-derived solution structure of the Tudor domain of Drosophila Polycomblike (Pcl), which is involved in transcriptional regulation at the level of chromatin remodeling. It was hypothesized that Pcl may act as a targeting factor of a repressive complex by recognition of methylated histone tails through its Tudor domain. Our data, however, show that the Pcl Tudor domain has an atypical aromatic cage, which does not bind to any of the predicted putative Tudor ligands, rendering a role in targeting rather unlikely. A structural comparison to Tudor-SN highlights a hydrophobic surface patch as a potential interaction site, where binding of other domains or proteins in the repressive complex could occur. In Chapter 5, data on the recently discovered trimeric RES (retention and splicing) complex are presented. RES is involved in splicing and nuclear export of messenger mRNAs. I present a preliminary biophysical characterization, and provide evidence that the interaction of two of the components involves a novel, extended variation of a so-called UHM-ULM (U2AF Homology Motif- UHM Ligand Motif) protein-protein interaction. 15N relaxation experiments indicate that approximately 25 amino acids in the ULM peptide tightly interact with the UHM domain. Chemical shift analysis suggests that a helix is formed in the ULM peptide upon binding. NMR data has been acquired for a structural elucidation of this protein-peptide complex. Finally, Chapter 6 briefly covers additional short projects I was involved in during my PhD. Many of them included validation of small-molecule ligands that had been found to interact with their targets in different kinds of primary screens.     «

Gene expression is a highly regulated process in our eukaryotic cells. To accomplish tight and dynamic control, regulatory functions affect protein production at various stages. The structural and biochemical work presented in this doctoral thesis, focuses on proteins involved in pre-mRNA splicing, one of the key steps in mRNA maturation, as well as on proteins engaged in chromatin remodeling. Notably, post-translational modifications, such methylation of arginine or lysine residues, have been s...     »

Die Expression des genetischen Codes ist ein hoch regulierter Prozess in eukaryontischen Zellen. Die entsprechenden Aspekte der Proteinexpression in der Zelle unterliegen einer strengen und dynamischen Regulation. Die vorliegende Dissertation beschreibt strukturelle und biochemische Untersuchungen von Proteinen, die eine Rolle spielen für das RNA Spleißen, einem Schlüsselschritt der Reifung der Boten RNA, sowie für die Remodellierung des Chromatins spielen. Kapitel 1 und 2 geben eine Einführung in die verschiedenen Aspekte der Regulation der Genexpression sowie die strukturbiologische Verfahren. Ziel ist es, einen Überblick über grundlegende regulatorische Prozesse vom Gen zum Protein zu geben. Dabei liegt die Betonung darauf, molekulare Aspekte zu skizzieren und aufzuzeigen, wie die verschiedenen Signalwege eng miteinander verflochten sind. Strukturbiologie umfasst recht unterschiedliche aber komplementäre Methoden. Hier werden vor allem grundlegende Aspekte der Kernspinresonanz („nuclear magnetic resonance“, NMR) Spektroskopie besprochen, sowie ihr Potential für die Untersuchung der Struktur, Dynamik und Wechselwirkungen von biologischen Makromolekülen aufgezeigt. Kapitel 3 beschreibt die drei-dimensional Struktur der sogenannten TSN Domäne des Tudor-SN Proteins, die ein erweitertes Tudor Domänen Faltungsmotiv darstellt. Die Struktur wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bestimmt. NMR 15N Relaxationsmessungen und dipolare Restkopplungen („residual dipolar couplings“, RDCs) zeigen, das TSN eine kompakte Struktur einnimmt und dass die beiden Untereinheiten sich in Lösung gemeinsam reorientieren, konsistent mit der Kristallstruktur. Mittels NMR Titrationen konnte gezeigt werden, dass die TSN Domäne Peptide mit symmetrisch dimethylierten Argininen (sDMA) bindet. Die Erkennung wird durch einen aromatischen Käfig der Tudor Domäne vermittelt. Dimethylarginin-modifizierte Proteine sind von großer Bedeutung für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich des Spleißosoms. Meine Ergebnisse liefern Hinweise dafür, wie Tudor-SN mit dem Spleißosom wechselwirken und seine Assemblierung und Effizienz verstärken kann. Kapitel 4 stellt die NMR Struktur der Tudor Domäne des Drosophila „Polycomblike“ (Pcl) Proteins vor, das in die Regulation von Transkription auf der Ebene der Remodellierung des Chromatins impliziert ist. Es wurde vorhergesagt, dass Pcl eine Rolle für die Lokalisierung einen repressiven Komplexes einnimmt, durch Erkennung methylierter Histonendungen mittels seiner Tudor Domäne. Unsere Daten zeigen allerdings, dass die Pcl Tudor Domäne einen atypischen aromatischen Käfig aufweist, der an keinen der vorhergesagten, möglichen Tudor Liganden bindet. Eine Funktion der Tudordomäne für die Lokalisierung erscheint daher nicht wahrscheinlich. Ein Strukturvergleich mit Tudor-SN zeigt, dass eine hydrophobe Oberfläche existiert, die mögliche Wechselwirkungen mit anderen Domänen oder Proteinen des repressiven Komplexes vermitteln könnte. In Kapitel 5 werden Untersuchungen zum kürzlich entdeckten ternären RES („retention and splicing“) Komplex vorgestellt. RES spielt eine Rolle im Spleißen und Kernexport von Boten RNAs. Ich stelle meine Ergebnisse hinsichtlich der biophysikalischen Charakterisierung vor und liefere Hinweise dafür, dass die Bindung von zwei Komponenten des RES Komplexes durch eine neue, erweiterte Variante von sogenannten UHM-ULM („U2AF Homology Motif- UHM Ligand Motif“) Protein-Protein Wechselwirkungen vermittelt wird. 15N Relaxationsexperimente zeigen, dass etwa 25 Aminosäurereste des ULM Peptids an der UHM Bindung beteiligt sind. Eine Analyse von chemischen Verschiebungsänderungen zeigt, dass durch die Bindung eine Helix innerhalb des ULM Peptids induziert wird. Zahlreiche NMR Daten wurden aufgenommen, die eine Strukturbestimmung des Protein-Peptidkomplexes ermöglichen. Im abschließenden Kapitel 6 werden einige kurze Projekte beschrieben, an denen ich im Laufe meiner Promotion beteiligt war. Viele dieser Projekte betreffen die Validierung der Bindung von kleinen organischen Molekülen an verschiedene Zielproteine, die aufgrund verschiedener primärer Assays beschrieben war.     «

Die Expression des genetischen Codes ist ein hoch regulierter Prozess in eukaryontischen Zellen. Die entsprechenden Aspekte der Proteinexpression in der Zelle unterliegen einer strengen und dynamischen Regulation. Die vorliegende Dissertation beschreibt strukturelle und biochemische Untersuchungen von Proteinen, die eine Rolle spielen für das RNA Spleißen, einem Schlüsselschritt der Reifung der Boten RNA, sowie für die Remodellierung des Chromatins spielen. Kapitel 1 und 2 geben eine Einführu...     »