New theoretical, experimental and computational methods for time-resolved Laue crystallography of macromolecules have been developed. A solution to the energy-overlap problem in Laue diffraction is described that does not require redundancy in the measurements. The new method follows a Bayesian approach with multi-dimensional probability density functions. The intensity components of reflection multiplets are deconvoluted, and estimates of their precision are obtained. The Laue patterns are processed to their physically relevant wavelength-dependent resolution limit; no "soft-parameters" are involved. The power of the method is demonstrated by the test applications to bovine trypsin, sperm whale myoglobin and 2Mn-catalase from Thermus thermophilus. In the example of trypsin, the completeness at low and medium resolution as well as at very high resolution (1.4 e) is enhanced very substantially as compared to standard procedures; the "low-resolution hole" problem is practically solved. As a consequence, the contrast in electron density maps improves so far that they become comparable in quality to maps from monochromatic data of the same resolution. The new method is of interest for all types of Laue diffraction experiments, in particular for single-shot time resolved studies on short time scales. In a stroboscopic test study of ground-state CO myoglobin, the Bayesian method permitted to obtain the electron density maps that showed the correct ligand conformation at resolution 1.7 e. The resolution that was achieved using DORIS and the map contrast are higher as compared to the earlier experiments of this type that has been carried out at the third generation synchrotron source. The possibility to obtain interpretable maps in a single-shot Laue experiment is demonstrated for the example of cubic catalase. A limited-bandwidth Laue method using a graphite monochromator with 2.5% bandwidth has been developed and tested in study of lysozyme at ultra-high resolution (<1.2 e). A new algorithm for autoindexing Laue diffraction patterns has been developed and implemented in a computer program. Successful tests of this procedure on structures with relatively large cell constants >200 e are presented.
Übersetzte Kurzfassung:
Neue theoretische, experimentelle und rechnerische Methoden für die zeitaufgelöste Laue-Kristallographie von Makromolekülen wurden entwickelt. Eine Lösung für das Energieüberlappungsproblem der Laue-Diffraktion wird beschrieben, die keine Redundanz in den Messdaten erfordert. Die neue Methode nutzt Bayes-Statistik mit mehrdimensionalen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen. Die Intensitätskomponenten der Reflexmultiplets werden entfaltet und ihre Genauigkeit abgeschätzt. Die Laue-Beugungsbilder werden bis zur jeweiligen physikalisch relevanten wellenlängenabhängigen Auflösungsgrenze bearbeitet, ohne dabei "Soft parameter" anzunehmen. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird anhand von Testanwendungen an Rindertrypsin, Pottwal-Myoglobin und 2Mn-Katalase des Thermus thermophilus demonstriert. Im Fall von Trypsin liegt die Vollständigkeit bei niedrigen und mittleren sowie bei sehr hohen Auflösungen (1.4 e) im Vergleich zu Laue-Standardmethoden um ein Vielfaches höher. Das Problem der geringen Vollständigkeit im Breich niederer Auflösung ("low-resolution-hole") ist praktisch gelöst. Als Folge erhöht sich der Kontrast der Elektronendichtekarten so weit, dass sie in ihrer Qualität mit Karten vergleichbar sind, die auf monochromatischen Daten gleicher Auflösung beruhen. Die neue Methode ist für alle Arten von Laue-Beugungsexperimenten, insbesonders auch für zeitaufgelöste Studien aufgrund einer einzigen Aufnahme (single shot) in kurzem Zeitmaßstab von Interesse. In einer stroboskopischen Teststudie an CO-Myoglobin im Grundzustand ermöglichte es die Bayes-Methode, Elektronendichtekarten zu erhalten, die die korrekte Konformation der Liganden bei einer Auflösung von 1.7e zeigten. Die Auflösung und der Kontrast der Dichtekarten, die aufgrund von Messungen an DORIS erhalten wurden, sind höher als bei früheren Experimenten dieser Art, obwohl diese an Strahlungsquellen der dritten Generation durchgeführt wurden. Die Möglichkeit interpretierbare Karten mit Single-Shot-Laue-Experimenten zu erhalten, wird am Beispiel von kubischer Katalase demonstriert. Zudem wurde eine Laue-Methode mit reduzierter Bandbreite (2.5%) unter Verwendung eines Graphit-Monochromators entwickelt und am Beispiel von Lysozym bei extrem hoher Auflösung (< 1.2 e) getestet. Schließlich wurde ein neuer Algorithmus zur Autoindizierung von Laue-Beugungsmustern entwickelt und in einem Computerprogramm implementiert. Erfolgreiche Anwendungen dieses Verfahrens auf Strukturen mit vergleichsweise großen Zellkonstanten werden vorgestellt.
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