Der metabotrope Glutamatrezeptor Typ 1 (mGluR1) wird in zerebellären Purkinje-Neuronen (PN) stark exprimiert und ist für die motorische Funktion des Kleinhirns entscheidend. An den Parallelfaser-(PF)-Synapsen der PN ruft die Aktivierung von mGluR1 eine komplexe Antwort hervor. Diese besteht aus einem langsamen exzitatorischen postsynaptischen Potential (sEPSP), das durch den canonical transient receptor potential channel (TRPC) TRPC3 vermittelt wird, und der Inositoltrisphosphat-Rezeptor-(IP3R)-abhängigen Calciumfreisetzung aus dem Calciumspeicher im endoplasmatischen Retikulum (ER). In nicht-erregbaren Zelltypen erfordert das Wiederauffüllen der ER-Calciumspeicher die Interaktion zwischen dem ER-Calciumsensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) und dem Calciumkanal Orai1 in der Plasmamembran (PM). In zerebellären PNs steuert STIM1 sowohl die ER-Calciumspeicher als auch das TRPC3-vermittelte sEPSP. Allerdings werden die mGluR1-abhängigen Signale in Abwesenheit von STIM1 in PN-spezifischen STIM1-Knockout-(STIM1pko)–Mäusen durch Calciumeinstrom durch spannungsgesteuerte Calciumkanäle vollständig, jedoch nur vorübergehend, wiederhergestellt. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, wie die TRPC3-Aktivierung durch Calcium reguliert wird und wie dies mit der Calcium-Homöostase in Kleinhirn-PN zusammenhängt. Mit Hilfe von Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen in Kombination mit konfokaler Calcium-Bildgebung in akuten Kleinhirnschnitten von STIM1pko-Mäusen konnte ich zunächst zeigen, dass die durch nur eine Sekunde andauernde Depolarisation wiederhergestellte TRPC3-Aktivierbarkeit den durch die Depolarisation ausgelösten Calciumtransienten um Minuten überdauert. Desweiteren ist die depolarisationserzeugte Reaktivierbarkeit von TRPC3 unempfindlich gegenüber dem SERCA-Antagonisten Cyclopiazonsäure (CPA) und dem "langsamen" Calciumchelatbildner EGTA. Dagegen wird sie durch intrazelluläre Perfusion mit dem "schnellen" Calciumpuffer BAPTA verhindert. Das bedeutet, dass TRPC3 nicht durch direkte Bindung von Calciumionen reguliert wird, sondern durch enge räumliche Kopplung (im Nanometerbreich; „nanodomain“) eines in Nähe zur PM befindlichen Calcium-bindenden Regulators an eine STIM1-gesteuerte Calciumleitfähigkeit wie Orai1. Allerdings ist im Gehirn das homologe Protein zu Orai1, Orai2, häufiger als Orai1. Die Bedeutung dieses spezifischen Expressionsmusters für die Funktion von Neuronen ist nicht bekannt. Mit einer quantitativen RT-PCR-Untrsuchung konnte ich bestätigen, dass Orai2 die am häufigsten vorkommende Orai-Untereinheit im Kleinhirn ist. Immunfärbungen zeigten die Anwesenheit von Orai2-Protein im somatodendritischen Kompartiment von PN in Wildtyp-Mäusen und normale PN-Morphologie in generellen (Orai2-/-) und PN-spezifischen (Orai2pko) Knockout-Mäusen. Sowohl bei Orai2-/- als auch bei Orai2pko-Mäusen wurden in Verhaltenstests motorische Beeinträchtigungen festgestellt. In Orai2-defizienten Mäusen zeigten die mGluR1-Aktivierung durch synaptische Stimulation oder Agonistenapplikation, direkte Stimulation der IP3R durch IP3-Uncaging und lokale Applikation des Ryanodinrezeptoragonisten Koffein, dass die Calciumfreisetzung aus dem ER und die mGluR1-abhängige Aktivierung von TRPC3 in Abwesenheit von Orai2 praktisch eliminiert sind. Beide mGluR1-abhängige Signale wurden transient durch VGCC-vermittelten Calciumeinstrom wiederhergestellt, verglichen mit STIM1pko-Mäusen jedoch mit geringerer Effizienz. Ähnlich wie bei STIM1pko-Mäusen war diese Wiederherstellung nicht empfindlich gegenüber CPA oder EGTA, sondern nur gegenüber BAPTA. Diese Daten weisen auf eine essentielle Rolle von Orai2 in PN und sehr wahrscheinlich in Neuronen im Allgemeinen hin. In Ruhe ist der Ionenkanal für die Auffüllung des ER-Calciumspeichers verantwortlich. Darüber hinaus zeigt diese Arbeit erstmals eine andere Rolle als die Calcium-Homöostase für ein Orai-Protein: Durch die Kopplung zwischen mGluR1 und TRPC3 ist Orai2 direkt an der synaptischen Übertragung, der neuronalen Aktivität und der sensomotorischen Integration im Kleinhirn beteiligt.      «

Der metabotrope Glutamatrezeptor Typ 1 (mGluR1) wird in zerebellären Purkinje-Neuronen (PN) stark exprimiert und ist für die motorische Funktion des Kleinhirns entscheidend. An den Parallelfaser-(PF)-Synapsen der PN ruft die Aktivierung von mGluR1 eine komplexe Antwort hervor. Diese besteht aus einem langsamen exzitatorischen postsynaptischen Potential (sEPSP), das durch den canonical transient receptor potential channel (TRPC) TRPC3 vermittelt wird, und der Inositoltrisphosphat-Rezeptor-(IP3R)-...     »

The metabotropic glutamate receptor type 1 (mGluR1) is highly expressed in cerebellar Purkinje neurons (PNs) and is crucial for cerebellar motor function. At parallel fiber (PF) - PN synapses, activation of mGluR1 evokes a complex response consisting of a slow excitatory postsynaptic potential (sEPSP) mediated by the canonical transient receptor potential (TRPC) channel TRPC3 and inositoltrisphosphate receptor- (IP3R)-dependent calcium release from endoplasmic reticulum (ER) calcium stores. In non-excitable cell types ER calcium store replenishment requires the interaction between the ER calcium sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) and the calcium channel Orai1 in the plasma membrane (PM). Calcium homeostasis is less well studied in neurons, and the mechanism of TRPC3 activation downstream of mGluR1 is unknown. In cerebellar PNs, STIM1 controls both ER calcium stores and the TRPC3-mediated sEPSP. However, mGluR1-responsiveness is fully yet transiently rescued in the absence of STIM1 in PN-specific STIM1 knockout (STIM1pko) mice by calcium influx through voltage-gated calcium channels (VGCCs). The aim of this work was to elucidate how TRPC3 activation is regulated by calcium and how this relates to calcium homeostasis in cerebellar PNs. Using whole-cell patch-clamp recordings in combination with confocal calcium imaging in acute cerebellar slices from STIM1pko mice I first showed that the rescue of TRPC3 activability by depolarization for one second outlasts the resulting calcium transient by minutes, is not sensitive to the antagonist of SERCAs cyclopiazonic acid (CPA) and the “slow” calcium chelator EGTA but was abolished by intracellular perfusion with the “fast” calcium buffer BAPTA. Thus, TRPC3 is not regulated by direct binding of calcium ions but by PM-delimited nanodomain coupling of a calcium-binding regulator to a STIM1-controlled calcium conductance such as Orai1. In the brain, however, the homolog of Orai1, Orai2, is more abundant than Orai1. The significance of this specific expression pattern for neuronal function is not known. Using a quantitative RT-PCR approach I confirmed that Orai2 is the most abundant Orai subunit in the cerebellum. Immunostaining proved the presence of Orai2 protein in the somatodendritic compartment of PNs in wild type mice and normal PN morphology. Streptavidin-staining of biocytin-filled PNs in cerebellar slices demonstrate normal morphology of PNs in general (Orai2-/-) and PN-specific (Orai2pko) knockout mice. However, behavioral tests revealed motor impairments in both Orai2-/- and Orai2pko mice. In both Orai2-/- and Orai2pko mice synaptic and agonist activation of mGluR1, IP3 uncaging, and local application of the ryanodine receptor (RyR) agonist caffeine showed that calcium release from the ER and TRPC3 activation are practically eliminated in the absence of Orai2. Again, mGluR1-dependent responses were rescued transiently by VGCC-mediated calcium influx, although with lower efficiency compared to STIM1pko mice. Similarly to STIM1pko mice, this rescue was not sensitive to CPA or EGTA but to BAPTA. These data point to an essential role of Orai2 in PNs and very likely neurons in general. At rest, it is the ion channel that is responsible for ER calcium store replenishment. Moreover, by enabling the coupling between mGluR1 and TRPC3 it is directly involved in synaptic transmission, neuronal activity and sensorimotor integration in the cerebellum.      «

The metabotropic glutamate receptor type 1 (mGluR1) is highly expressed in cerebellar Purkinje neurons (PNs) and is crucial for cerebellar motor function. At parallel fiber (PF) - PN synapses, activation of mGluR1 evokes a complex response consisting of a slow excitatory postsynaptic potential (sEPSP) mediated by the canonical transient receptor potential (TRPC) channel TRPC3 and inositoltrisphosphate receptor- (IP3R)-dependent calcium release from endoplasmic reticulum (ER) calcium stores. In n...     »