Halbautomatische Verfahren der elektronenmikroskopischen Datenaufnahme und nachfolgender computergestützter Bildverarbeitung ermöglichen die Strukturbestimmung eines Proteinkomplexes mit mittlerer Auflösung (~25 Å) innerhalb weniger Tage. Um dieses Potential auszuschöpfen, ist eine deutliche Beschleunigung der klassischen Probenvorbereitung aus biologischem Material erforderlich. Dafür wurden beispielhaft Zelllysate von Thermoplasma acidophilum auf Hydroxyapatit, MonoQ und nativen PA-Gelen fraktioniert. Mittels der neu entwickelten „Grid-Blotting“-Methode, wurden EM-Proben direkt aus den fokussierten Proteinbanden extrahiert. Die Zeit vom Zellaufschluss bis zum fertigen EM-Präparat betrug so weniger als 48 h. Für eine zukünftige Automatisierung der „Grid-Blotting“-Methode wurde weiters eine Gelprozessierungsplattform entwickelt, die basierend auf der intrinsischen Fluoreszenz von Proteinen deren Detektion in PA-Gelen ohne Markierung oder Färbung ermöglicht.     «

Halbautomatische Verfahren der elektronenmikroskopischen Datenaufnahme und nachfolgender computergestützter Bildverarbeitung ermöglichen die Strukturbestimmung eines Proteinkomplexes mit mittlerer Auflösung (~25 Å) innerhalb weniger Tage. Um dieses Potential auszuschöpfen, ist eine deutliche Beschleunigung der klassischen Probenvorbereitung aus biologischem Material erforderlich. Dafür wurden beispielhaft Zelllysate von Thermoplasma acidophilum auf Hydroxyapatit, MonoQ und nativen PA-Gelen frakt...     »

Semi-automated methods for electron microscopic data aquisition and subsequent digital image processing facilitate structure determination of protein complexes with moderate resolution (~25 Å) within a few days. In order to make full use of this potential, a significant acceleration of sample preparation from biological material is required. For that, crude lysates of Thermoplasma acidophilum were fractionated on Hydroxyapatite, MonoQ and native PA gels. Using the newly developed ‘Grid-blotting’ technique, EM samples were directly extracted from the focussed protein bands within the gel. Sample processing, from cell disruption until the final EM fixation step, was accomplished in less than 48 h. For future automation approaches of the ‘Grid-blotting’ technique, a gel processing platform was developed. This robot facilitates protein detection in PA gels based on the intrinsic fluorescence of proteins. Thus, the usage of tags or staining procedures is avoided.     «

Semi-automated methods for electron microscopic data aquisition and subsequent digital image processing facilitate structure determination of protein complexes with moderate resolution (~25 Å) within a few days. In order to make full use of this potential, a significant acceleration of sample preparation from biological material is required. For that, crude lysates of Thermoplasma acidophilum were fractionated on Hydroxyapatite, MonoQ and native PA gels. Using the newly developed ‘Grid-blotting’...     »