Human umbilical cord blood constitutes a rich source of endothelial progenitor cells (EPC) capable of differentiation into functional mature endothelial cells. The endothelium is a key modulator in the pathogenesis of inflammatory vasculopathies such as atherosclerosis. Specifically, Interleukin-1 (IL-1) plays a major role in the proinflammatory activation of the endothelium and the propagation of the vascular inflammatory process. Aim of this study was to examine the potential of Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) - transduced cord blood-derived endothelial cells (CBEC) to inhibit the vascular inflammatory aspects involved in the pathogenesis of atherosclerosis. For this purpose, cord blood-derived CD34+ EPC were differentiated into CBEC and retrovirally transduced with the constructs pLXSN and pLXSN-icIL-1ra, respectively, and expanded up to 1020 cells during in vitro culture. Transgene expression of the intracellular isoform of IL-1ra was confirmed by RT-PCR and Western Blot and quantified by ELISA throughout the expansion period, demonstrating that transduced cells showed a stable expression of IL-1ra over at least 4 months of culture. In the following, the effect of transgenic icIL-1ra expression on distinct processes involved in inflammatory vasculopathies was investigated. CBEC gene expression analysis (real time RT-PCR) revealed that steady state levels of the adhesion receptor ICAM-1 and the proinflammatory mediators MCP-1 and thrombin receptor were significantly reduced in transgenic CBEC. Endothelial cell activation induced by monocytes, IL-1ß and TNFα stimulation was assessed by flow cytometry and real time RT-PCR. We observed that monocyte-induced upregulation of ICAM-1, VCAM-1, and tissue factor was significantly inhibited in icIL-1ra-transduced CBEC. Furthermore, transgenic CBEC showed a decreased proinflammatory activation profile upon cytokine stimulation. Interestingly, the ectopically expressed icIL-1ra did not only reduce IL-1ß-induced CBEC activation, but also influenced TNF-induced stimulation. In particular, TNF-induced ICAM-1 expression was reduced by icIL-1ra. Functionally, as assessed by flow chamber measurements and adhesion assays, expression of the icIL-1ra transgene reduced leukocyte rolling and adhesion to resting CBEC as well as IL-1ß stimulated CBEC. Furthermore, transendothelial migration of monocytes through transgenic CBEC was markedly diminished as determined in an in vitro transmigration chamber. Our findings demonstrate that CBEC can reliably be isolated, transduced, and expanded into clinically relevant numbers. CBEC stably expressing icIL-1ra show an enforced protection against activation by proinflammatory stimuli and display a significantly reduced response in the decisive pathomechanisms of inflammatory vasculopathies - rolling, adhesion, and transmigration of leukocytes. Therefore, icIL-ra transgenic CBEC show potential to be used in the treatment of IL-1ß- as well as TNFα-mediated inflammatory vasculopathies.     «

Human umbilical cord blood constitutes a rich source of endothelial progenitor cells (EPC) capable of differentiation into functional mature endothelial cells. The endothelium is a key modulator in the pathogenesis of inflammatory vasculopathies such as atherosclerosis. Specifically, Interleukin-1 (IL-1) plays a major role in the proinflammatory activation of the endothelium and the propagation of the vascular inflammatory process. Aim of this study was to examine the potential of Interleukin-1...     »

Menschliches Nabelschnurblut enthält eine große Anzahl Endothelvorläuferzellen (EPC), die in reife, funktionstüchtige Endothelzellen differenzieren können. Das Endothel nimmt eine Schlüsselposition in der Pathogenese entzündlicher Gefäßkrankheiten wie der Atherosklerose ein. Insbesondere das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung des Endothels und der Vermittlung entzündlicher Prozesse in der Gefäßwand. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, aus Stammzellen des Nabelschnurbluts Endothelzellen (CBEC) zu differenzieren, sie mit dem Transgen Interleukin-1 Rezeptorantagonist (IL-1ra) genetisch zu modifizieren und ihr Potential zu ermitteln, gefäßentzündliche Aspekte in der Pathogenese der Atherosklerose zu hemmen. Dafür wurden CD34+ EPC aus Nabelschnurblut in CBEC differenziert, mit den retroviralen Konstrukten pLXSN und pLXSN-IL-1ra transduziert und auf über 1020 Zellen expandiert. Die transgene Expression der intrazellulären Isoform des IL-1ra wurde mittels RT-PCR und Western Blot nachgewiesen und durch ELISA während des gesamten Expansionszeitraums quantifiziert. Dabei konnte eine stabile Expression von IL-1ra über mindestens 4 Monate der in vitro Kultur nachgewiesen werden. Nachfolgend wurde der Effekt der transgenen Expression von icIL-1ra in CBEC auf für entzündliche Gefäßkrankheiten charakteristische Prozesse untersucht. Genexpressionsanalysen (real time RT-PCR) ergaben, dass transgene CBEC signifikant geringere basale Level des Adhäsionsrezeptors ICAM-1 und der proinflammatorischen Mediatoren MCP-1 und Thrombinrezeptor aufwiesen. Durch Monozyten, IL-1ß und TNFα (tumor necrosis factor alpha) induzierte endotheliale Aktivierung wurde mittels Flusszytometrie und real time PCR untersucht. Dabei stellte sich eine signifikante Reduktion der monozyteninduzierten Expression von ICAM-1, VCAM-1 und Tissue Factor in icIL-1ra-transduzierten CBEC heraus. Desweiteren ergab die Analyse ein vermindertes proinflammatorisches Aktivierungsmuster transgener CBEC nach Zytokinstimulation. Der ektopisch exprimierte icIL-1ra hemmte dabei nicht nur IL-1ß-induzierte, sondern auch TNFα-mediierte endotheliale Stimulation. So wurde die TNFα-induzierte ICAM-1 Expression durch icIL-1ra vermindert. Funktionelle Untersuchungen in Fließkammermessungen und Adhäsionsexperimenten ergaben, dass die Produktion von icIL-1ra sowohl das Rolling als auch die feste Adhäsion von Leukozyten auf nicht aktivierten und IL-1ß-stimulierten CBEC signifikant abschwächte. Weiterhin war die transendotheliale Migration von Monozyten durch transgene CBEC stark vermindert, wie Messungen in Transmigrationskammern zeigten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass CBEC zuverlässig isoliert, transduziert und in klinisch relevante Mengen expandiert werden können. CBEC mit stabiler Expression des icIL-1ra Transgens haben einen erhöhten Schutz gegen die Aktivierung durch proinflammatorische Stimuli und weisen eine verminderte Reaktion in den für entzündliche Gefäßerkrankungen entscheidenden Pathomechanismen - Rolling, Adhäsion und Transmigration von Leukozyten - auf. Somit zeigen icIL-1ra-transduzierte CBEC das Potential, in der Therapie entzündlicher Gefäßkrankheiten eingesetzt zu werden.     «

Menschliches Nabelschnurblut enthält eine große Anzahl Endothelvorläuferzellen (EPC), die in reife, funktionstüchtige Endothelzellen differenzieren können. Das Endothel nimmt eine Schlüsselposition in der Pathogenese entzündlicher Gefäßkrankheiten wie der Atherosklerose ein. Insbesondere das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine wichtige Rolle in der Aktivierung des Endothels und der Vermittlung entzündlicher Prozesse in der Gefäßwand. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, aus Stammzelle...     »