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- Originaltitel:
- Quantitative Analyse von Makromolekülen in Kryoelektronentomogrammen mittels Korrelationsmethoden
- Übersetzter Titel:
- Quantitative Analysis of Macromolecules in Cryoelectron Tomograms using Correlation Methods
- Autor:
- Förster, Friedrich
- Jahr:
- 2005
- Dokumenttyp:
- Dissertation
- Fakultät/School:
- Fakultät für Physik
- Betreuer:
- Baumeister, Wolfgang (Prof. Dr.)
- Gutachter:
- Baumeister, Wolfgang (Prof. Dr.); Rief, Matthias (Prof. Dr.); Kleber, Manfred (Prof. Dr.)
- Format:
- Text
- Sprache:
- de
- Fachgebiet:
- CHE Chemie; DAT Datenverarbeitung, Informatik
- Stichworte:
- Elektronenmikroskopie; Bildverarbeitung; Strukturbiologie; Tomographie
- Übersetzte Stichworte:
- electron microscopy; bildverarbeitung; structural biology; tomography
- Schlagworte (SWD):
- Elektronenstrahltomographie; Kryofixierung; Bildauswertung; Bildkorrelation; Makromolekül
- TU-Systematik:
- CHE 264d; DAT 764d
- Kurzfassung:
- Die Elektronentomographie (ET) ist hervorragend geeignet, um die dreidimensionale (3D) Struktur pleomorpher biologischer Strukturen wie etwa Zellen oder Organellen abzubilden. Die Weiterentwicklungen der Technik in den letzten 10 Jahren machen es heutzutage möglich, in vitrifiziertem Eis eingebettete biologische Objekte dreidimensional abzubilden. Diese Probenpräparation gewährleistet optimale Strukturerhaltung und beläßt die biologischen Proben in einer annähernd nativen Umgebung. Demnach liefert Kryo-ET (KET), die ET vitrifizierter biologischer Proben, ein naturgetreues 3D Abbild z.B. ganzer Zellen, und sie ist derzeit die einzige Technik, die einzelne makromolekulare Komplexe in ihrer natürlichen Umgebung aufzulösen vermag.
Das vorrangige Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zur quantitativen Auswertung von Kryotomogrammen zu entwickeln und anzuwenden. Die größte Herausforderung bei der Analyse von Kryoelektronentomogrammen ist ihr außerordentlich niedriges Signal-zu-Rauschverhältnis, das in der Strahlenempfindlichkeit biologischer Proben begründet liegt. Ein weiteres Hindernis bei der Interpretation ist ein Keil fehlender Strukturdaten im Fourierraum, der vom eingeschränkten Kippbereich der Probe im Elektronenmikroskop herrührt. Während die erste Tatsache zur Wahl korrelationsbasierter Techniken zur Datenanalyse führte, wurde der zweiten Rahmenbedingung durch die Entwicklung neuer Korrelationsfunktionen, die die Analyse auf den experimentell zugänglichen Bereich einschränken, Rechnung getragen.
Im Detail wurden Methoden zum Einsatz in drei zentralen Aufgabenstellungen der KET entwickelt und angewendet: (i) Ein Ziel der Tomographie ganzer Zellen ist es, einen zellulären Atlas makromolekularer Komplexe zu erhalten. Hierfür wurde ein Algorithmus zur Detektion spezifischer Makromoleküle anhand ihrer strukturellen Signatur entwickelt und zur Lokalisierung von Komplexen in Phantomzellen, pro- und eukaryotischen Zellen angewandt. (ii) KET ist in der Lage, sehr fragile supramolekulare Komplexe abzubilden. Durch Mittelung von Subtomogrammen können diese in höherer Auflösung strukturell charakterisiert werden, wozu ein iteratives Verfahren implementiert wurde. Dieses wurde zur in situ Strukturbestimmung eines retroviralen Env Proteinkomplex’ und des Kernporenkomplex’ bis zu einer Auflösung von (3nm)−1 bzw. (8-9nm)−1 benutzt. (iii) Eine systematische Analyse der in einer biologischen Probe enthaltenen makromolekularen Komplexe erfordert eine statistische Analyse, die homogene Subpopulationen identifiziert. Es wurde eine Klassifikationsmethode entwickelt, die Artefakte der üblichen Principal Component Analysis bei der Anwendung auf KET-Daten deutlich verringerte. - Übersetzte Kurzfassung:
- Electron Tomography (ET) is uniquely suited to obtain three-dimensional (3D) reconstructions of pleomorphic structures, such as cells or organelles. The technical advances of the instrumentation within the last 10 years enable us nowadays to image biological objects which are embedded in vitreous ice three-dimensionally. This preparation technique provides the best structural preservation and maintains the biological sample in its natural environment. Thus, Cryo-ET (CET), the ET of vitrified biological specimens, provides a faithful representation of the 3D structure of specimens such as cells, and it is currently the only technique being able to resolve single macromolecular complexes in their native environment.
The major objective of this work was the development and application of methods for a quantitative evaluation of cryoelectron tomograms. The major challenge in the analysis of cryoelectron tomograms is their extremely low signal-to-noise ratio arising from the radiation sensitivity of biological materials. A further hindrance in the interpretation is a missing wedge of structural data in Fourier space which is due to the limited tilt range of the sample in the electron microscope. While the former condition lead to the choice of correlation based data analysis techniques, the latter constraint was considered by the development of novel correlation functions limiting the analysis to the experimentally sampled data range.
In detail, the methods developed and applied in this work address three central tasks of CET: (i) It is one goal of tomography of whole cells to derive a cellular atlas of macromolecular complexes. Therefore, an algorithm was developed which detects individual macromolecules based on their structural signature. It was applied in order to localize complexes in phantom cells, pro-, and eukaryotic cells. (ii) CET is able to image very fragile supramolecular complexes. These can be characterized structurally by employing averaging of subtomograms. Therefore, an iterative averaging procedure was designed and employed in order to determine the structures of the retroviral Env protein complex and the nuclear pore complex to a resolution of (3 nm)−1 and (8-9 nm)−1, respectively. (iii) A systematic analysis of the macromolecular complexes populating a biological sample requires the statistical analysis of the data in order to identify homogeneous subpopulations. A classification procedure was developed that overcomes the artifacts of the wide-spread Principal Component Analysis when applied to CET data. - Veröffentlichung:
- Universitätsbibliothek der TU München
- WWW:
- https://mediatum.ub.tum.de/?id=603087
- Eingereicht am:
- 30.03.2005
- Mündliche Prüfung:
- 20.06.2005
- Dateigröße:
- 54310099 bytes
- Seiten:
- 172
- Urn (Zitierfähige URL):
- https://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:91-diss20050705-1255463598
- Letzte Änderung:
- 27.08.2007
BibTeX
Vorkommen: