Es gilt als gesichert, dass Prionen Auslöser einer Reihe neurodegenerativer Krankheiten beim Menschen (Creutzfeldt-Jakob-Krankheit) und Tieren (BSE) sind. Die Krankheitserreger, Prionen, entstehen aus dem nativen, membrangebundenen Prion-Protein (PrPc) durch eine Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur. Prion-Proteine binden spezifisch Kupfer. Paramagnetisches Cu behindert den Einsatz etablierter Methoden zur Strukturaufklärung auf Basis der NMR-Spektroskopie. Lediglich die Struktur des C-terminalen Teils (Residuen 121-231) wurde mittels NMR-Spektroskopie gelöst. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung des Kupferbindungsplatzes in der N-terminalen Domäne des Proteins mittels einer neuentwickelten Methode zur Strukturbestimmung. Die Domäne besteht aus vier Wiederholungen einer Sequenz aus acht Aminosäuren, der Octarepeat-Sequenz. Untersuchungen wurden sowohl an synthetisierten Peptidfragmenten als auch an vollständigen humanen Prion-Proteinen durchgeführt. Aus der EXAFS-Spektroskopie lagen Informationen über den Abstand der ersten Liganden zum Cu-Zentrum vor. Er beträgt etwa 1.95Å. Außerdem wurde das Ligandieren eines His-Imidazolrings nachgewiesen. Der Bindungswinkel des His-Nδ wurde auf Cu-Nδ-Cγ=133° bestimmt. Die Vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf EPR- und ENDOR-Spektroskopie. Mit EPR wurde die axiale Symmetrie des Komplexes und die ligandierenden Atomarten, 3 Stickstoffatome und 1 Sauerstoffatom, bestimmt. Der Abstand von Protonen und deren Lage bezüglich der Molekül-Symmetrieachse ist durch ENDOR-Spektroskopie bestimmbar. Charakteristische Linien zeigen beispielsweise His-Hε1 und die Hα-Protonen der Glycine. Die Lage von weit entfernten Stickstoffatomen wurde mit ESEEM-Spektroskopie bestimmt. Die Koordination eines Imidazolrings, aufgrund charakteristischer EXAFS-Spektren bereits vermutet, konnte so bestätigt werden. Außerdem stehen für die Peptidkette stereochemische Informationen wie Bindungswinkel, Bindungslängen oder die Planarität der Peptidbindung zur Verfügung. Die unterschiedliche Natur der Abstandsinformationen verglichen mit der NMR-Spektroskopie machte eine neuartige Strategie für die Simulated-Annealing-Computeroptimierung nötig. Sie wurde in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für BioMolekulare Optik, LMU München, entwickelt. Bei diesem Rechenverfahren wurden Computermodelle von insgesamt 189 verschiedenen Komplexkonfigurationen generiert, von jeder dieser Konfigurationen wurden 1200 Peptidkonformationen errechnet. Nach einer Plausibilitätsprüfung dieser insgesamt 226800 Konformationen und nach Überprüfung ihrer Kompatibilität mit allen gemessenen Daten ergibt sich eine Struktur, bei der das Nδ des Imidazolrings, die Rückgratstickstoffe von Gly3 und Gly4, und der Carbonylsauerstoff des Gly4 in einer Ebene ligandieren. In der axialen Position koordiniert ein Wassermolekül. Die Ergebnisse aus den Untersuchungen der Octarepeat-Cu-Komplexe sind nicht ohne weiteres auf kupferbeladene Prion-Proteine übertragbar. Da sich die EPR-Spektren der Prion-Proteine von denen der Peptide unterscheiden, kann die Komplexierung des Cu mit vier Stickstoffatomen nicht ausgeschlossen werden. Die ähnliche Lage der ENDOR-Resonanzen belegt eine ähnliche planare Koordination der Stickstoffe wie bei den Octapeptiden. Die Untersuchungen an vollständigen humanen Prion-Proteinen ergeben außerdem eine starke Abhängigkeit der gebildeten Komplexe vom pH-Wert. Während bei Octapeptid/Cu-Komplexen die Bildung von Doppelkomplexstrukturen zuverlässig ausgeschlossen werden kann, ist das bei vollständigen Prion-Protein-Proben wesentlich aufwendiger. Die notwendigen EPR-Titrationsexperimente sind noch nicht abgeschlossen.     «

Es gilt als gesichert, dass Prionen Auslöser einer Reihe neurodegenerativer Krankheiten beim Menschen (Creutzfeldt-Jakob-Krankheit) und Tieren (BSE) sind. Die Krankheitserreger, Prionen, entstehen aus dem nativen, membrangebundenen Prion-Protein (PrPc) durch eine Änderung der Sekundär- und Tertiärstruktur. Prion-Proteine binden spezifisch Kupfer. Paramagnetisches Cu behindert den Einsatz etablierter Methoden zur Strukturaufklärung auf Basis der NMR-Spektroskopie. Lediglich die Struktur des C-ter...     »

Prion-proteins are to be considered as the cause of neurodegenerative diseases in humans (Creutzfeldt-Jakob-disease) and animals (BSE). The infectious agent, “prion”, is formed out of the native, membrane-bound protein (PrPc) through a change in the secondary and tertiary protein structure. Prion-proteins bind copper specifically and with high affinity. Paramagnetic copper hampers the use of established methods of structural refinement basing upon NMR-spectroscopy. Only the structure of the C-terminal domain of the protein (residues 121-231) was solved using NMR-spectroscopy. This work concentrates on the characterisation of the copper binding site in the N-terminal domain of the protein by utilising a newly developed method for structural refinement. The domain consists of four repeats of a peptide-sequence that is eight amino-acids long, the so-called octarepeat-sequence. The work was done on both, synthesised peptide fragments and complete human prion-proteins. From EXAFS-spectroscopy information on the distance between the copper centre and the first ligands were available. This distance is about 1.95Å. Moreover the ligation of a His-imidazole-ring was proven. The binding-angle of the His-Nδ could be determined, Cu-Nδ-Cγ=133°. This work concentrates on EPR and ENDOR spectroscopy. With EPR the axial symmetry of the complex and the types of the first ligands, 3 nitrogen and 1 oxygen atoms, could be assigned. The distance of the protons and their position relative to the symmetry-axis were determined with ENDOR-spectroscopy. Characteristic lines are caused by the His-Hε1 and the Hα-protons of the glycin residues. The position of the nitrogen-atoms can be fixed with ESEEM-spectroscopy. The coordination of a histidine-imidazole ring, which was suspected because of characteristic EXAFS-spectra, could be confirmed. For the peptide-chain moreover, there exist stereochemical information like bond lengths, angles and the planarity of the peptide-bond. The different of distance information yielded by the experiments compared with NMR required a new strategy for the simulated-annealing computer optimisation. This optimisation was developed in cooperation with the Lehrstuhl für BioMolekulare Optik, LMU München. In this calculation method computer-models of 189 different complex configurations were generated, for each of these configurations 1200 conformations were calculated. After testing the plausibility of each of these 226800 conformations and after a check for the compatibility with our measurements the method yielded a structure, in which the Nδ of the His imidazolering, the backbone nitrogen atoms of Gly3 and Gly4 and the carbonyl-oxygen of the Gly4 coordinate the copper in a planar way. One axial position is ligated by a water molecule. The results of the research on the octapeptide-Cu-complexes can not be transferred easily to copper-complexed prion-proteins. The EPR-spectra of prion-proteins and peptides are different, so the ligation of the copper by four nitrogen-ligands cannot be excluded. The similar position of the ENDOR resonance-lines proves the same planar position of the nitrogen atoms as in the octarepeat-fragments. The measurements on complete human prion-proteins also yield a strong dependence of the complex structure on the pH-value of the solution. Whereas the formation of Cu-Cu-double complex-structures can be excluded in the octarepeat-fragments, this is much more difficult in the samples containing complete human prion-proteins. The required EPR-titration-experiments are not finished yet.     «

Prion-proteins are to be considered as the cause of neurodegenerative diseases in humans (Creutzfeldt-Jakob-disease) and animals (BSE). The infectious agent, “prion”, is formed out of the native, membrane-bound protein (PrPc) through a change in the secondary and tertiary protein structure. Prion-proteins bind copper specifically and with high affinity. Paramagnetic copper hampers the use of established methods of structural refinement basing upon NMR-spectroscopy. Only the structure of the C-te...     »