Die Elektronentomographie ist die am allgemeinsten anwendbare Technik zur dreidimensionalen Strukturforschung mittels Elektronenmikroskopie. Es ist die einzige Methode zur Untersuchung pleomorpher Strukturen, von supramolekularen Komplexen, Organellen und zellulären Modellsystemen bis hin zu ganzen Zellen. Durch die Einführung automatisierter Datenerfassungssysteme ist es neuerdings möglich, in Eis eingebettete biologische Systeme in quasi-nativem Zustand zu untersuchen. Die vielversprechendste Entwicklung der Elektronentomographie ist ihre Anwendung auf zelluläre Organellen und ganze Zellen: Erstmals können makromolekulare Komplexe in ihrer quasi-nativen Umgebung dreidimensional visualisiert werden. Die Identifikation dieser Komplexe anhand ihrer strukturellen Signatur war bei der bislang erzielten Auflösung jedoch noch nicht möglich. Ein vorrangiges Ziel war folglich die Auflösung von zellulären Objekten zu verbessern. Die durchgeführte Installation eines 300 kV Mikroskops mit Feldemissionskathode und eines Energiefilters ermöglichte es erstmals, pleomorphe eiseingebettete Präparate mit einer Auflösung unter 4 nm abzubilden. Die dreidimensionale Untersuchung eines Modellsystems zur Injektion viraler DNS in Wirtszellen hat nicht nur gezeigt, dass die Auflösung um den Faktor 2 verbessert werden konnte; zusätzlich erlaubte die verbesserte Abbildungsqualität wichtige Rückschlüsse zur Wechselwirkung zwischen Virus und Wirt zu ziehen: Der Virenschwanz vollzieht beim Binden an das Wirtsprotein eine drastische Konformelle Änderung und dringt ca. 23 nm in den Wirt ein. Die strukturelle Untersuchung führte zu einem mechanistischen Modell, welches den Transfer der viralen DNS durch die Zellhülle beschreibt. Obwohl die Qualität der tomographischen Rekonstruktionen verbessert werden konnte, ist eine Interpretation der Tomogramme durch visuelle Inspektion auf Grund des hohen Rauschanteils schwer vorstellbar. Folglich wurden rechnerisch realisierbare Algorithmen zur Identifikation makromolekularer Komplexe entwickelt und auf verschiedene Modellsysteme angewandt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Identifikation schon bei schlechterer Auflösung möglich ist, falls die molekularen Komplexe aus dem Zellverbund aufgereinigt werden. Bei einer Präparatdicke ab 250 nm ist eine Auflösung von 4 nm notwendig, um strukturell ähnliche Komplexe, wie z.B. das Thermosom, GroEL oder das 20S Proteasom zu unterscheiden. Die Anwendung der Algorithmen auf Protein-gefüllte Vesikel - sogenannte Phantomzellen - zeigt, dass mit dem momentanen experimentellen Aufbau bereits mehr als 90% der Partikel in einer quasi-zellulären Umgebung korrekt identifiziert werden können.     «

Die Elektronentomographie ist die am allgemeinsten anwendbare Technik zur dreidimensionalen Strukturforschung mittels Elektronenmikroskopie. Es ist die einzige Methode zur Untersuchung pleomorpher Strukturen, von supramolekularen Komplexen, Organellen und zellulären Modellsystemen bis hin zu ganzen Zellen. Durch die Einführung automatisierter Datenerfassungssysteme ist es neuerdings möglich, in Eis eingebettete biologische Systeme in quasi-nativem Zustand zu untersuchen. Die vielversprechendste...     »

Electron tomography is the most widely applicable method for obtaining three-dimensional information by electron microscopy. It is, in fact, the only method for investigationg pleomorphic structures, ranging from supramolecular assemblies, organelles and cellular model systems to whole cells. With the recent developments of automated data-acquisition schemes, it is now possible to study biological systems embedded in vitreous ice under low-dose conditions with minimal perturbations of the physiologic state. The most promising development in electron tomography is its application to cellular organelles and whole cells: macromolecular complexes can now be visualized three-dimensionally in their native cellular environment with molecular resolution. However, the identification of these macromolecular complexes by virtue of their structural signature is not possible at the resolutions reached so far. Consequently, a major challenge was to improve the resolution of electron tomograms of cellular objects. The installation of a 300 kV microscope with a field-emission gun and an energy filter allows to visualize pleomorphic biological samples three-dimensionally with a resolution below 4 nm for the first time. The three-dimensional analysis of a model system for the injection of viral DANN into host cells did not only reveal that the resolution could be improved by a factor of two, but the advanced imaging capabilities also allow to draw important conclusions concerning the interactions of virus and host: upon binding to the bacterial receptor protein, the tail undergoes a major conformational change and protrudes 23 nm into the host. This observation led to a mechanistic model how the viral DNA is transferred across the cell envelope. Even though the quality of the tomographic reconstructions could be improved, one cannot expect to be able to interpret such tomograms by visual inspection. Hence, computational feasible algorithms to identify macromolecular complexes within the cellular environment were mapped out and applied to several model systems. The results show that the identification is possible even at lower resolutions, given that the macromolecular complexes are purified biochemically from the cellular context. For specimens thicker than 250 nm, a resolution better that 4 nm turns out to be necessay to distinguish complexes structurally as similar as the Thermosome, GroEL and the 20S Proteasome. The application of the identification algorithms to protein-filled vesicles - so called phantom cells - reveals that more than 90 % of the particles can be identified correctly within their quasi-cellular anvironment with the presently used setup.     «

Electron tomography is the most widely applicable method for obtaining three-dimensional information by electron microscopy. It is, in fact, the only method for investigationg pleomorphic structures, ranging from supramolecular assemblies, organelles and cellular model systems to whole cells. With the recent developments of automated data-acquisition schemes, it is now possible to study biological systems embedded in vitreous ice under low-dose conditions with minimal perturbations of the physio...     »