Die Verbindung zwischen einer malignen Erkrankung und gesteigerter Blutgerinnung ist seit langem nachgewiesen. Thromboembolische Komplikationen treten bei Patienten mit einer malignen Erkrankung gehäuft auf. Auf Tumorzellen wurde die Überexpression des spezifischen Rezeptors für die Serinprotease Thrombin nachgewiesen, aber die Rolle von Thrombin bei malignen Erkrankungen erst ansatzweise geklärt. Eine Ursache für die gesteigerte Invasion von Tumorzellen ist die Stimulation von Proteasen. Aufgrund der Spezifität für extrazelluläre Matrixproteine haben die Matrixmetalloproteasen eine zentrale Bedeutung bei der Invasion von Tumorzellen. Die Auflösung der Basalmembran ist dabei ein wichtiger Schritt zur Ausbildung von Metastasen. Typ-IV Kollagenasen (MMP-2 und –9) degradieren spezifisch Kollagen Typ-IV und damit die kollagenen Hauptbestandteile der Basalmembran. Wir untersuchten den Einfluß von Thrombin auf die Expression der Typ-IV Kollagenase (MMP-9, 92 kDa Gelatinase) in einer Osteosarkomzellinie U-2 OS. Die Osteosarkom-Zellen produzieren kein MMP-9, wie in der Gelatinzymographie und der Northern-Blot-Analyse gezeigt werden konnte. Zugabe von humanem Thrombin induziert einen konzentrationsabhängigen Anstieg der MMP-9-Sekretion. Weniger als 0,5 U Thrombin/ml bewirkt einen Anstieg der Aktivität, und durch Inkubation mit 1 U Thrombin/ml wird ein etwa fünffacher Anstieg der pro-MMP-9-Aktivität beobachtet. Parallel zu der Sekretion des MMP-9-Proteins steigt die Transkription des MMP-9-Gens nach Gabe von Thrombin, wie in der Northern-Blot-Analyse und in den transienten Transfektionen gezeigt wurde. Die Induktion der Transkription von MMP-9 beginnt nach 4 h und persistiert für mindestens 24 h. Die pro-MMP-9-Aktivität steigt nach 7 h und erreicht das Maximum nach 24 h. Um die spezifische Beteiligung des Thrombinrezeptors in der Stimulation von MMP-9 nachzuweisen, wurde das Thrombinrezeptor-aktivierende Peptid (TRAP) verwendet. 24 h nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von TRAP wurde im Überstand der U-2 OS-Zellen ein konzentrationsabhängiger Anstieg der MMP-9-Aktivität beobachtet. Transiente Transfektionen mit verschiedenen 5’-Deletionen des MMP-9-Promotors zeigten, daß eine Sequenz zwischen –670 und –634 für die Induktion von MMP-9 auf der Transkriptionsebene verantwortlich ist. Die Stimulation von MMP-9 durch Thrombin wird mit Ly 294002, einem Inhibitor der PI-3-Kinase, verhindert. Die Zugabe von verschiedenen Inhibitoren des MAPK-Kinaseweges (SB 203580, PD 98059) beeinflußte die Induktion durch Thrombin nicht. In einem Metastasierungsmodell der extrazellulären Matrix mit einer Matrigelmembran wurde gezeigt, daß die Invasion der Osteosarkomzellen durch Stimulation mit Thrombin gesteigert wird. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß Thrombin eine Protease (MMP-9) induziert, die für die Auflösung der Basalmembran wichtig ist. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, den Mechanismus der thrombininduzierten Invasion von Tumorzellen besser zu verstehen.     «

Die Verbindung zwischen einer malignen Erkrankung und gesteigerter Blutgerinnung ist seit langem nachgewiesen. Thromboembolische Komplikationen treten bei Patienten mit einer malignen Erkrankung gehäuft auf. Auf Tumorzellen wurde die Überexpression des spezifischen Rezeptors für die Serinprotease Thrombin nachgewiesen, aber die Rolle von Thrombin bei malignen Erkrankungen erst ansatzweise geklärt. Eine Ursache für die gesteigerte Invasion von Tumorzellen ist die Stimulation von Proteasen. Aufgru...     »

The association between malignancies and thrombophilic states has long been established, and thromboembolic complications often occur in patients with malignant diseases. Overexpression of the receptor for the serine protease thrombin involved in coagulation has been reported for tumor tissue cells, although the role of thrombin for the malignant phenotype remains poorly understood. Therefore we speculated that thrombin might regulate proteases, and examined the influence of thrombin on the expression of the Mr 92,000 gelatinase (Mr 92,000 type IVcollagenase, also referred to as MMP-9) in an osteosarcoma cell line U-2 OS. We choosed to analyze MMP-9, because it is involved in remodelling of the extracellular matrix and promotes the invasiveness of malignant cells. U-2 OS cells produce no MMP-9 as evidenced by gelatin zymography and Northern blot analysis. Addition of human thrombin to U-2 OS cells, however, induced a dose-dependent increase in secretion of MMP-9. As little as 0.5 U/ml of thrombin induced MMP-9 production and addition of 2 U/ml showed a 5-fold increase of MMP-9 activity. MMP-9 protein secretion was paralleled by an increase in MMP-9 transcription after thrombin stimulation, as shown by Northern blots and transient transfections. The induction of MMP-9 RNA and MMP-9 gelatinase activity began 6 h after thrombin addition and persisted for at least another 18 h. To determine whether the thrombin receptor is involved in the MMP-9 stimulation observed, we made use of the thrombin receptor-activating peptide (TRAP). After 24 h incubations with various concentrations of TRAP, U-2 OS cells showed a dose-dependent increase in gelatinase activity. Transient transfections with several 5´-deletions of the MMP-9 promoter showed that a MMP-9 promoter sequence between -670 and -634 bp is responsible for the induction of MMP-9 at the transcriptional level. Addition of several inhibitors of key signal transduction pathways (SB203580, PD098059, AG1478) did not change MMP-9 induction by thrombin. In contrast, stimulation of MMP-9 with thrombin was prevented by Ly294002, a specific inhibitor of PI3-kinase. Moreover, addition of U-2 OS cells increased cell invasion through the extracellular matrix (Matrigel), indicating that thrombin is increasing invasiveness. Our finding that thrombin is inducing a protease important for degradation of the extracellular matrix (MMP-9) might help to explain the mechanism how thrombin promotes tumor invasion.     «

The association between malignancies and thrombophilic states has long been established, and thromboembolic complications often occur in patients with malignant diseases. Overexpression of the receptor for the serine protease thrombin involved in coagulation has been reported for tumor tissue cells, although the role of thrombin for the malignant phenotype remains poorly understood. Therefore we speculated that thrombin might regulate proteases, and examined the influence of thrombin on the expr...     »