The focus of this thesis was on the structural characterization of three groups of proteins: the cytoskeleton related proteins, insulin-like growth factor binding proteins and proteases. For cytoskeletal proteins, the structures of actin cross-linking protein, filamin (FLN) from Dictyostelium discoideum, and the cyclase-associated protein (CAP) were solved by X-ray crystallography and NMR methods, respectively. The structure of the filamin rod domain (repeats 4, 5 and 6) reveals an extended rod configuration of limited flexibility. This structure indicates that a full-length rod domain should be able to cross-link actin filaments over a distance of about 400 Å. The rod domain is built by six repeats, each having an immunoglobulin-like fold; these are interconnected by short linkers and stabilized by salt bridges. The last C-terminal repeats of this domain are involved in dimerization. Homodimerization is essential for the function of filamin. In continuation of the work described in this thesis, structures of larger fragments of filamin are planned to be studied in the future. The structure of an N-terminal domain of the Dictyostelium cyclase associated protein (CAP-N) was studied by NMR. This protein is important for downregulation of actin polymerization and cytoskeletal response to cell signaling. The NMR structure appears to be an all-a-helix bundle. Detailed analysis of flexible parts of CAP-N and comparison to X-ray model were performed. The second aim of this thesis was on the structural characterization of insulin-like growth factor (IGF) binding proteins (IGFBPs). Two structures of the IGF binding fragments of IGFBPs were solved in complex with IGF, with the resolutions of 1.6 Å and 2.5 Å, revealing the presence of an unusual disulphide-ladder subdomain and explaining the mechanism of binding and inhibition of IGF. Additionally, a model of the C-terminal domain of IGFBPs and its interactions with IGF and N-terminal IGFBP was build based crystallographic data, which were not however sufficient to build an atomic resolution ternary complex structure. Finally, structures of serine protease SplC from Staphylococcus aureus and metallo-carboxypeptidases (CPA and CPB) in complex with tick and leech inhibitors were resolved. The SplC serine protease is considered as potential virulence factor of this bacterium. This structure, solved by remote-SAD phasing, represent serine protease fold with an unusual autoinhibition mechanism of blocking the catalytic histidine by an adjacent flexible loop. Also, the staphostatin A protein structure of this bacterium was analyzed by NMR. Additionally, a structure of tick carboxypeptidase inhibitor (TCI) in complex with CPA and CPB was studied. The novel structure of TCI reveals interesting double-headed binding mechanism allowing the molecule to adapt to different carboxypeptidases. The structure of CPB is assumed to be the closest analog of the human TAFI carboxypeptidase, a very important target for drug design. Leach carboxypeptidase inhibitor (LCI) folding intermediates in complex with CPA and in free form were also characterized by X-ray crystallography and NMR experiments.     «

The focus of this thesis was on the structural characterization of three groups of proteins: the cytoskeleton related proteins, insulin-like growth factor binding proteins and proteases. For cytoskeletal proteins, the structures of actin cross-linking protein, filamin (FLN) from Dictyostelium discoideum, and the cyclase-associated protein (CAP) were solved by X-ray crystallography and NMR methods, respectively. The structure of the filamin rod domain (repeats 4, 5 and 6) reveals an extended rod...     »

Im Mittelpunkt dieser Doktorarbeit stehen die strukturellen Untersuchungen von drei Proteingruppen: die zytoskelettanverwandten Proteine, insulinähnliche wachstumfaktorbindende Proteine und Proteasen. Die Strukturen von Aktin bindenden Proteinen, Filamin (FLN) aus Dictyostelium discoideum und Adenylyl Cyclase assoziertem Protein (CAP) wurden mit Hilfe von Röntgenkrystallographie (X-ray) und der Kernresonanzspektroskopie (NMR) bestimmt. Die Struktur von der Filamin Rod Domäne (Einheiten 4, 5 und 6) sagt etwas über die erweiterte Konfiguration mit einer beschränkten Flexibilität aus. Die Struktur deutet darauf hin, dass die volle Länge von der Rod Domäne in der Lage sein soll, die Wechselwirkung über der Distanz von ungefähr 400 Å mit Aktin Filaments durchführen zu können. Die Rod Domäne besteht aus sechs Wiederholungen. Jede der Wiederholungen hat eine immunoglobinähnliche Faltung, die mit der kleineren Verbindung angeschlossen und durch Salzbrücken stabilisiert ist. Die letzte C- terminale Wiederholung von dieser Domäne ist bei der Dimerisierung beteiligt. Die Homodimerisierung wird für die Funktion von Filamin benötigt. Als Fortsetzung, von den hier beschriebenen Untersuchungen, werden demnächst die Strukturen von den längeren Konstrukten von Filamin bearbeitet. Die Struktur von der N- terminalen Domäne von Adenylyl Cyclase-assoziertem Protein (CAP-N) wurde mit Hilfe NMR studiert. Dieses Protein reguliert Aktins-polymerisation als Antwort auf zellulare Signale. Die NMR Struktur von CAP-N zeigt ein α-helikales Bündel aus 6 antiparallelen Helices. Die detallierten Studien von den flexiblen Fragmenten von CAP-N sowie auch ein Vergleich der NMR Struktur mit der Kristallstrukur sind ebenfalls durchgeführt worden. Im zweitem Teil der vorliegenden Dissertation wurden die strukturellen Wechselwirkungen von insulinähnlichen wachstumsfaktorbindenden Proteinen (IGFBPs) beschrieben. Es wurden zwei Strukturen von den insulinähnlichen Wachstumfaktoren (IGF’s) von IGFBPs im Komplex mit IGF, mit der Auflüsung von 1.6 Å und 2.5 Å, bestimmt. Sowohl die Anwesenheit der ungewönlichen Disulfidleitern als auch des Bindungs- und Inhibitionsmechanismus von IGF sind in der beschriebenen Struktur aufgedeckt. Zusätzlich wurde ein Model von der C-terminale Domäne von IGFPs mit IGF und mit der N-terminalen Domäne von IGFBP als dreifacher Komplex vorgeschlagen. Zusätzlich wurden die Kristallstrukturen von der Serinprotease SpIC aus Staphylococcus aureus und von der Metallocarboxipeptidase (CPA und CPB) im Komplex mit „tick“und „leech“ Inhibitoren bestimmt. Die SpIC Serinprotease wird als eine potenzielle Bösartigkeit der Bakterie Staphylococcus aureus angesehen. Die vorgestellte Struktur ist mit SAD (single-wavelenght anomalous dispersion) Phasing gelöst und stellt die Serinprotease Faltung mit einem ungewöhnlichen – Histidin blockierenden Mechanismus dar. Die Struktur von Staphostatin A Protein ist mit der Hilfe von NMR analysiert worden. Letztlich wurde die Struktur von Tick-carboxipeptidase Inhibitor (TCI) im Komplex mit CPA und CPB untersucht. Diese neuartige Struktur von TCI zeigt einen sehr interessanten Bindungmechanismus, der eine Anpassung von dem Inhibitor an verschiedenen Carboxipeptidasen ermöglicht. Die Struktur von CPB ist übereinstimmend zu menschlichen Carboxipeptidase TAFI und hat dadurch für die Entwicklung von den Wirkstoffen eine sehr grosse Bedeutung. Leach Carboxipeptidasen Inhibitor (LCI) Faltungszwischenstadien sind sowohl im Komplex mit CPA als auch in der ungebundenen Form mit Hilfe von X-ray und NMR analysiert worden.     «

Im Mittelpunkt dieser Doktorarbeit stehen die strukturellen Untersuchungen von drei Proteingruppen: die zytoskelettanverwandten Proteine, insulinähnliche wachstumfaktorbindende Proteine und Proteasen. Die Strukturen von Aktin bindenden Proteinen, Filamin (FLN) aus Dictyostelium discoideum und Adenylyl Cyclase assoziertem Protein (CAP) wurden mit Hilfe von Röntgenkrystallographie (X-ray) und der Kernresonanzspektroskopie (NMR) bestimmt. Die Struktur von der Filamin Rod Domäne (Einheiten 4, 5 und...     »