Among all the halogens, fluorine is known to produce the most interesting properties when used for substitution/modification in proteins due to its possibility to dramatically change their spectral properties. The primary advantage of such a rational redesign is the opportunity to introduce specifically targeted changes since the chromophore of autofluorescent proteins is completely encoded in its amino acid sequence. The unique spectral properties of proteins such as EGFP and dsRed might be used as sensitive probes and reporters of the interactions within the chromophore and between the chromophore and its protein matrix. Thus variations of the chromophore itself as well as of its surrounding protein matrix by classical protein engineering were performed. In this study, site-directed mutagenesis is supplemented with methods for incorporation of monofluorinated aromatic amino acids in order to create novel classes of autofluorescent proteins. The rationale of incorporating electronegative fluorine atoms is to (a) covalently modify the chromophore (which can cause a fundamental change of its resonance properties) and (b) manipulate electrostatic interactions between the chromophore and its surrounding protein environment in order to change its spectral properties. This was brought about by global replacements of tyrosine residues with 2- and 3-fluorotyrosine in EGFP and EYFP. Such replacements resulted in shifts in pKa-values, anion/cation equilibrium upon titration, blue/red shifts in absorbance and fluorescence. These differences are more pronounced in fluorinated EYFPs than in EGFPs due to the fluorination of Tyr203, unique for the EYFPs. Modelling studies indicate conformational space for possible chromophore flipping in fluorinated EGFPs but not for fluorinated EYFPs due to its involvement in stacking interactions with Tyr203. Indeed, the three dimensional structure of 3-fluorotyrosyl EGFP in the crystalline state revealed two conformational states of fluorine in the chromophore as well as in the majority of (3-F)Tyr-side chains in this protein. Astonishingly, in (2-F)Tyr-EGFP, both the chromophore, and other 2-fluorotyrosyl residues globally represent only one conformeric state. These properties are undoubtedly intrinsic features of the fluorinated chromophores in the context of the rigid surrounding protein matrix. In addition, the crucial Tyr203 in EYFP was replaced with Phe by site-directed mutagenesis and subsequently fluorinated at ortho-, meta- and para-positions in order to further manipulate the spectral properties of EYFP. Contrary to our expectations, ortho- and meta-fluorinations of the Tyr-residues in dsRed did not induce significant changes in the spectral profiles of these variants, possibly due to partial replacements of the analogues. Cytotoxic and pharmacological properties of fluorinated aromatic amino acids have still not received enough attention in recent years. The overall protein structure is unchanged upon replacement of native Tyr and Trp residues with their isosteric fluorinated analogues since they resemble their canonical counterparts in shape and size. In this way, pharmacologically active or cytotoxic amino acids that might serve as diagnostic markers, are covalently integrated into the polypeptide in an inactive prodrug form and should exert no toxicity during delivery. In order to test this concept, a preliminary examination in cell lines using fluorinated variants (fluorinated Tyr, Phe, and Trp analogues) of enhanced green fluorescent protein and β-galactosidase are presented in this study as well. In this context, attempts to incorporate analogues of aliphatic amino acids like Met and Leu containing a trifluoromethyl group into EGFP are presented as well. The most interesting property of these noncanonical amino acids is their enhanced hydrophobicity. This feature is often exploited to improve the performance of small drugs in suppressing metabolic toxicity, increasing bioavailability in the delivery of many pharmaceuticals or enhancing drug activity. Until now attempts to globally substitute Leu and Met residues with their trifluoro-analogues in GFP have resulted in only marginal replacement.     «

Among all the halogens, fluorine is known to produce the most interesting properties when used for substitution/modification in proteins due to its possibility to dramatically change their spectral properties. The primary advantage of such a rational redesign is the opportunity to introduce specifically targeted changes since the chromophore of autofluorescent proteins is completely encoded in its amino acid sequence. The unique spectral properties of proteins such as EGFP and dsRed might be use...     »

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluß von der Substitution aromatischer und aliphatischer Aminosäuren durch fluorinierter Analoge auf Proteine untersucht. Mit Hilfe fluorinierten Varianten von EGFP und β-Galaktosidase in Zellinien wurde das Konzept überprüft, daß so veränderte Proteine als diagnostische Marker dienen könnten, welche in Zellen in inaktiver „prodrug“ Form eingeschleust werden und während der Einschleusung in die Zellen noch keine Toxizität ausüben. Es konnte gezeigt werden, daß die Halogenierung von aromatischen Aminosäuren, speziell der Austausch von Tyrosin durch Fluorotyrosin, dramatische Veränderungen der spektralen Eigenschaften von Proteinen hervorruft, ohne die räumliche Struktur zu verändern. Diese spektralen Eigenschaften dienen als sensible Reporter für Wechselwirkungen innerhalb des Chromophores oder zwischen Chromophor und Proteinmatrix. Es wurden verschiedene Varianten des Chromophores als auch der umgebenden Proteinmatrix durch „Protein-engineering“ hergestellt. Mittels ortsspezifischer Mutagenese in Kombination mit dem Einbau von monofluorinierten aromatischen Aminosäuren wurden neue Klassen von autofluoreszierenden Proteinen hergestellt. Mit dem Einbau von elektronegativen Fluor-Atomen in Proteine gelang es zum einen, den Chromophor kovalent zu modifizieren, zum anderen elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Chromophore und umgebender Proteinmatrix zu manipulieren. In den Proteinen EGFP und EYFP aus der Qualle Aequorea victoria wurde Tyrosin durch 2-Fluorotyrosin ((2-F)Tyr oder o-FTyr) und 3-Fluorotyrosin ((3-F)Tyr oder m-FTyr) ersetzt wodurch der direkte Einfluß dieses Austausches auf die Proteineigenschaften untersucht werden konnte. Es wurde gezeigt, daß sich der pKa-Werte der Proteine verändert sowie Änderungen im Anion/Kation-Äquilibrium bei Titrationsversuchen und Blau/Rot-Verschiebungen in Absorptions- und Fluoreszenzspektren auftreten. Diese Unterschiede traten verstärkt im fluorinierten EYFP auf und sind zurückzuführen auf die Fluorinierung von Tyr203, welches einzigartig in EYFP ist. Anhand von Modellingstudien konnte vorgeschlagen werden, das in einem Konformationszustand von EGFP Platz für ein mögliches Chromophore „flipping“ vorhanden ist, welches im EYFP nicht der Fall ist, da hier das Tyr203 aufgrund sterischer Hindernisse durch überlappende Wechselwirkungen beeinträchtigt ist. Tatsächlich konnten in den 3D-Strukturen von (3-F)Tyr EGFP zwei Konformationszustände vom Fluor im Chromophor im Kristall nachgewiesen werden, ebenso wie in der Mehrheit der (3-F)Tyr Seitenketten des Proteins. Erstaunlicherweise gibt es bei (2-F)TyrEGFP im Chromophore und anderen (2-F)Tyrresten nur einen Konformationszustand. Diese Eigenschaften sind zweifellos wesentliche Merkmale der fluorinierten Chromophore im Zusammenhang mit ihrer starren Proteinumgebung und sind verantwortlich für die einzigartigen Fluoreszenzeigenschaften von fluorinierten autofluoreszierenden Proteine. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit waren Inkorporationsversuche in GFP mit fluorinierten aliphatischen Aminosäuren wie Met und Leu, welche eine Trifluoromethyl-Gruppe besaßen. Die interessanteste Eigenschaft dieser nichtkanonischen Aminosäuren ist deren erhöhte Hydrophobizität. Diese Besonderheit wird oft zur Verbesserung der Leistung bei Medikamenten im Unterdrücken metabolischer Toxizität oder beim Erhöhen der Verfügbarkeit im Beliefern von vielen Pharmazeutika in die Zellen benutzt. Bis zum heutigen Zeitpunkt konnten nur geringfügige Substitutionen von Leucin- und Methioninresten mit deren Trifluoro-Analogen in GFP erreicht werden. Durch Erhöhung des genomischen Level der Methionyl-tRNA-Synthetase, könnte das Substitutionsniveau erhöht werden, mit dem eine fast quantitative Inkorporation von Trifluoromethionin in das Protein Annexin V erreicht werden konnte.     «

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluß von der Substitution aromatischer und aliphatischer Aminosäuren durch fluorinierter Analoge auf Proteine untersucht. Mit Hilfe fluorinierten Varianten von EGFP und β-Galaktosidase in Zellinien wurde das Konzept überprüft, daß so veränderte Proteine als diagnostische Marker dienen könnten, welche in Zellen in inaktiver „prodrug“ Form eingeschleust werden und während der Einschleusung in die Zellen noch keine Toxizität ausüben. Es konnte gezeigt werden, da...     »