Kernporenkomplexe ermöglichen den Stoffaustausch zwischen Zellkern und Zytoplasma. Im Rahmen dieser Arbeit wurden isolierte, transportaktive Zellkerne des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum mittels Kryo-Elektronentomographie untersucht. Diese Strategie ermöglicht die strukturelle Analyse von Kernporen (NPCs) im Zusammenhang mit der Kernhülle, als aktives Kerntransportsystem im quasi-nativen Zustand. Kernporen wurden in den erhaltenen Tomogrammen identifiziert und in einem Einzelpartikelverfahren analysiert. Die resultierende Kryo-EM-Struktur des D.discoideum-Kernporenkomplexes weist nicht nur alle bekannten morphologischen Details auf sondern wurde auch erstmals isotrop abgetastet und bis 8,8 nm aufgelöst. Durch die symmetrieunabhängige Analyse von etwa 4200 einzelnen NPC-Protomeren (asymmetrischen Einheiten) konnte die Auflösung bis auf 5,8 nm gesteigert werden und neue strukturelle Details wurden sichtbar. Einige Substrukturen der Kernporen, insbesondere die Masse im zentralen Kanal (CP) zeigten ein dynamisches Verhalten. Durch die Klassifizierung von NPC-Einzelpartikeln und die Lokalisierung von goldmarkierten Importkomplexen während des Transports, gelang es bestimmte Positionen des CP einzelnen Schritten des Importvorgangs zuzuordnen. Diese Korrelation zwischen strukturellen Zuständen und einzelnen Schritten des Kerntransports ermöglichte neue mechanistische Interpretationen.     «

Kernporenkomplexe ermöglichen den Stoffaustausch zwischen Zellkern und Zytoplasma. Im Rahmen dieser Arbeit wurden isolierte, transportaktive Zellkerne des Schleimpilzes Dictyostelium discoideum mittels Kryo-Elektronentomographie untersucht. Diese Strategie ermöglicht die strukturelle Analyse von Kernporen (NPCs) im Zusammenhang mit der Kernhülle, als aktives Kerntransportsystem im quasi-nativen Zustand. Kernporen wurden in den erhaltenen Tomogrammen identifiziert und in einem Einzelpartikelverfa...     »

Nuclear pore complexes (NPCs) are large macromolecular assemblies and the only gateways for nucleocytoplasmic exchange. Mainly due to their sheer size, the structural and functional characterization using traditional methods has been challenging. To analyze their structure in a close-to-life state, transport-active, intact nuclei from Dictyostelium discoideum were studied by means of cryo-electron tomography. Subvolumes of the tomograms containing individual NPCs were extracted in silico and subjected to three-dimensional classification and averaging, whereby distinct structural states were observed. The central plug/transporter (CP) was variable in volume and could occupy different positions along the nucleocytoplasmic axis, supporting the notion that it essentially represents cargo in transit. Changes in the position of the CP were accompanied by structural rearrangements in the NPC scaffold. Furthermore, gold labelling techniques were used to trace import complexes during their translocation. Implications for the transport mechanism are discussed. Finally, by performing a single particle analysis of about 4200 nuclear pore protomers (asymmetric units), an isotropically sampled structure resolved to 5.8 nm was obtained.     «

Nuclear pore complexes (NPCs) are large macromolecular assemblies and the only gateways for nucleocytoplasmic exchange. Mainly due to their sheer size, the structural and functional characterization using traditional methods has been challenging. To analyze their structure in a close-to-life state, transport-active, intact nuclei from Dictyostelium discoideum were studied by means of cryo-electron tomography. Subvolumes of the tomograms containing individual NPCs were extracted in silico and sub...     »