Bei den meisten intrazellulären Abbauprozessen von Proteinen erfolgt der erste Angriff auf die Zielproteine durch ATP-abhängige Proteasen. Diese Proteasen sind in der Regel größere, makromolekulare Komplexe, die eine fassartige Architektur aufweisen und ihre proteolytischen Aktivitäten in eigenen Reaktionskammern, sogenannten Kompartimenten, durchführen. Da diese Reaktionskammern für die meisten gefalteten Proteine unzugänglich sind, müssen diese zunächst von spezifischen ATPasen gebunden und entfaltet werden, bevor sie weiter zum katalytischen Zentrum geleitet werden können. Dort werden die Zielproteine von Proteasen wie beispielsweise dem Proteasom zu Peptiden mit einer Länge von 6-12 Aminosäuren gespalten und wieder freigesetzt. Um die Abbauprodukte der Zelle für den Metabolismus wieder zur Verfügung zu stellen, müssen diese kurzen Peptide zu freien Aminosäuren weiter hydrolysiert werden. In Thermoplasma acidophilum wird dieser letzte Schritt unter anderem von der Tricorn-Protease und den Tricorn-Faktoren, den Aminopeptidasen F1, F2 und F3, bewerkstelligt. Die Tricorn-Protease aus Thermoplasma acidophilum ist ein homohexameres Enzym mit einem Molekulargewicht von 121 kDa pro Untereinheit. Der hexamere Komplex stellt die katalytisch aktive Einheit dar. Der Name leitet sich von der Dreispitz-ähnlichen Struktur des hexameren Komplexes aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ab. Mittels Cryo-Elektronen-Tomographie konnte in vivo sogar eine ikosaedrische Capsidstruktur, bestehend aus 20 hexameren Untereinheiten und einem Molekulargewicht von 14,6 MDa beobachtet werden. Diese supramolekulare Organisation könnte der effizienteren Zuführung von Substraten an die mit Tricorn interagierenden Aminopeptidasen (F1, F2, F3) dienen. Diese Aminopeptidasen hydrolysieren die von der Tricorn-Protease freigesetzten Di- bis Tetrapeptide zu freien Aminosäuren weiter. Für röntgenkristallographische Untersuchungen wurden im Rahmen dieser Arbeit rekombinant exprimierte Tricorn-Hexamere kristallisiert und mittels ab initio Phasierung analysiert. Durch Kombination eines Maskenmodells aus CryoEM-3D-Rekonstruktionen in Kombination mit gemessenen Kristall-Daten wurde ein Strukturmodell von hoher Auflösung erreicht. Die Anwendung von Molekular-Ersatz-Techniken führte schließlich zu einem Atommodell mit einer Auflösung von 2,2 Å. Das Monomer der Tricorn-Protease wird aus fünf Domänen gebildet, wobei zunächst auf eine 6-blättrige eine 7-blättrige β-Propellerdomäne folgt. Hierauf schließt sich die katalytische Domäne mit α/β-Topologie an, welche aber durch eine eingefügte PDZ-Domäne in zwei Abschnitte geteilt wird. Zusätzlich wurden Untersuchungen an einem funktionellen Homolog der Tricorn-Protease, der Trilobed-Protease aus Pyrococcus furiosus durchgeführt. Der Name der Trilobed-Protease leitet sich ebenfalls aus der elektronenmikroskopisch beobachteten, Kleeblatt-ähnlichen Struktur ab. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, geeignete Bedingungen für ein Kristallwachstum der N-terminalen Domäne wie auch der Gesamtprotease zu etablieren. Aus röntgenkristallographischen Untersuchungen an der N-terminalen Trilobed-Domäne entstand ein Atommodell mit einer Auflösung von 2,0 Å, das eine 7-blättrige β-Propeller-Struktur aufwies. Diese Struktur wie auch beide Propellerdomänen der Tricorn-Protease gehören der Familie der non-velcro-Propeller an. Bei diesem Typ erfolgt ein offener Ringschluß zwischen dem ersten und letzten Propellerblatt. Abschließend wurde mit Hilfe eines Struktur-Vorhersage-Programms ein hypothetisches Modell der Trilobed-Gesamtprotease vorgestellt, das aber zur Bestätigung weiterer röntgenkristallographischer Untersuchungen bedarf.     «

Bei den meisten intrazellulären Abbauprozessen von Proteinen erfolgt der erste Angriff auf die Zielproteine durch ATP-abhängige Proteasen. Diese Proteasen sind in der Regel größere, makromolekulare Komplexe, die eine fassartige Architektur aufweisen und ihre proteolytischen Aktivitäten in eigenen Reaktionskammern, sogenannten Kompartimenten, durchführen. Da diese Reaktionskammern für die meisten gefalteten Proteine unzugänglich sind, müssen diese zunächst von spezifischen ATPasen gebunden und en...     »

In most intracellular degradation processes, proteins are first targets of ATP-dependent proteases. In general, these proteases are large macromolecular complexes of barrel-shaped architecture. The active sites are compartimentalised and therefore have their own reaction chambers. Folded proteins usually cannot access these compartments. They have to be bound specifically by ATPases to be unfolded and further translocated towards the catalytical centre. Proteases such as the Proteasome digest these unfolded substrates to oligopeptides of 6-12 amino acids, which, in turn, are released from the active site. As the degradation products are to be recycled in the cell, the short peptides have to be further hydrolysed to free amino acids. In Thermoplasma acidophilum, the Tricorn-interacting factors, the aminopeptidases F1, F2 and F3, are responsible for this task. The Tricorn protease from Thermoplasma acidophilum is a homohexameric enzyme with a molecular weight of 121 kDa per subunit. The hexamer represents the catalytically active unit and the name Tricorn was derived from its characteristic shape in electron micrographs. In vivo, an icosahedrical, supramolecular structure composed of 20 hexameric units and a molecular weight of 14,6 MDa can be observed, which might function to efficiently channel substrates from the Tricorn active sites towards the interacting factors (F1, F2, F3). These aminopeptidases hydrolyse the products derived from the Tricorn protease to free amino acids. For the x-ray-crystallographic examinations presented in this work, recombinantly expressed Tricorn hexamers were crystallized and analysed by ab initio phasing. A combination of a mask model calculated from cryoEM-3D reconstructions with measured crystal data resulted in a structure model of high resolution. Completing molecular replacement techniques led to a structure model of 2,2 Å resolution. The monomeric Tricorn protease is subdivided into 5 domains, in which at first a 7-bladed β-propeller follows a 6-bladed β-propeller. Attached hereunto is a catalytical domain with α/β-topology, the sequence of which is interrupted by a PDZ domain. Additionally, structural analyses on a functional homolog of the Tricorn protease, the Trilobed protease from Pyrococcus furiosus were carried out. The name of this peptidase was also deduced from its electron microscopic shape which resembles a trefoil. Suitable crystallisation conditions were established for the N-terminal domain as well as for the whole enzyme. From x-ray-crystallographic investigations of the N-terminal domain, a 2,0 Å model was calculated revealing a 7-bladed β-propeller. The Trilobed propeller domain as well as the propeller domains of the Tricorn protease belong to the family of non-velcro propellers, where the ring closure interface between the first and the last blade stays open. Finally, with the help of a tertiary structure prediction program, a hypothetical model of the whole Trilobed enzyme was presented but still requires an independent x-ray-crystallographic verification.     «

In most intracellular degradation processes, proteins are first targets of ATP-dependent proteases. In general, these proteases are large macromolecular complexes of barrel-shaped architecture. The active sites are compartimentalised and therefore have their own reaction chambers. Folded proteins usually cannot access these compartments. They have to be bound specifically by ATPases to be unfolded and further translocated towards the catalytical centre. Proteases such as the Proteasome digest th...     »