Das Phosphoenolpyruvat (PEP)-Synthase Homolog aus dem hyperthermophilen Archaeon Staphylothermus marinus wurde im Rahmen dieser Arbeit als erster archaebakterieller Vertreter der Familie PEP-verwendender Enzyme strukturell charakterisiert. Der aus dem Zytosol gereinigte hochmolekulare Proteinkomplex besteht aus einem einzigen Typ Untereinheit (Mr 93,7). STEM-Messungen des Komplexes ergaben ein Molekulargewicht von 2,25±0,23 MDa. Die multimere Organisation von MAPS (24±2,5 Untereinheiten) steht im Gegensatz zu den typischerweise di- oder tetrameren Strukturen der bakteriellen oder eukariontischen Vertretern dieser Proteinfamilie. Eine ausschließlich auf PCR basierende Strategie führte zur Ermittlung der gesamten Gensequenz. Multiple Sequenzalignierungen zeigten eine ausgeprägte Sequenzhomologie innerhalb der Familie PEP-verwendender Enzyme, und eine erstaunlich gute Konservierung der meisten Sekundärstrukturelemente. Eine Kombination von biochemischen und elektronenmikroskopischen Methoden deckte die ausgeprägte dreiteilige Domänenstruktur der Monomere auf. Die Untereinheiten sind konzentrisch angeordnet, so daß die N-terminale Domänen die äußere "Schale" bilden, die mittleren Domänen eine innere "Schale", und die C-terminalen Domänen eine Corestruktur bilden, die für die Assemblierung zu einem multimeren Komplex verantwortlich ist. Durch Experimente mit Deletionsmutanten und einem synthetischen Peptid wurde die Existenz eines kurzen, C-terminalen, alpha-helicalen Oligomerisierungsmotivs nachgewiesen. Es wird vorgeschlagen, daß dieses Motiv die Untereinheiten zu 6 Gruppen von jeweils 4 Monomeren bündelt. Jede der vier Untereinheiten eines Bündels interagiert mit einer anderen Untereinheit aus einem benachbarten Bündel, so daß 12 Dimere gebildet werden. Das gesamte Netzwerk von Interaktionen führt zur multimeren Struktur. Dem Modell entsprechend, zeigt jedes Bündel globulärer Domänen zu den Ecken eines imaginären Oktaeders. Die helicalen C-terminalen Segmente konvergieren auf das Zentrum des Partikels hin. Die Kanten des Oktaeders stellen die Kontakte zwischen Dimeren dar.     «

Das Phosphoenolpyruvat (PEP)-Synthase Homolog aus dem hyperthermophilen Archaeon Staphylothermus marinus wurde im Rahmen dieser Arbeit als erster archaebakterieller Vertreter der Familie PEP-verwendender Enzyme strukturell charakterisiert. Der aus dem Zytosol gereinigte hochmolekulare Proteinkomplex besteht aus einem einzigen Typ Untereinheit (Mr 93,7). STEM-Messungen des Komplexes ergaben ein Molekulargewicht von 2,25±0,23 MDa. Die multimere Organisation von MAPS (24±2,5 Untereinheiten) steht i...     »

The phosphoenolpyruvte (PEP)-synthases belong to the family of structurally and functionally related PEP-utilizing enzymes. The only archaeal member of this family characterized thus far is the multimeric PEP-synthase homologue from the hyperthermophilic archaeonStaphylothermus marinus . The large protein complex was isolated from the cytosol and consists of a single type of subunits (Mr 93,7). STEM mass measurements of the complex indicated a molecular mass of 2,25±0,23 MDa. This protein complex differs from the bacterial and eukaryotic representatives characterized to date in its homomultimeric (24±2,5 subunits), as opposed to dimeric or tetrameric, structure. The nucleotid sequence was obtained using a completely PCR-based strategy. A pronounced sequence homology is characteristic of the PEP-utilizing family of enzymes and multiple sequence alignments showed that most of the secondary structure elements are remarkably well conserved. The basic architecture of the protein complex was elucidated using controlled proteolytic dissection combined with electron microscopy. This approach revealed that the monomers possess a pronounced tripartite domain structure. The 24 subunits are arranged in a concentric fashion, such that the N-terminal domains form an outer "shell", the intermediate domains form an inner "shell" and the C-terminal domains form a core structure responsible for assembly into a multimeric complex. Deletion mutagenesis and studies using a chemically synthesized peptide facilitated the discovery of a short C-terminal sequence extension, that was identified as an alpha-helical oligomerization motif. It is proposed that this motif bundles the monomers into six groups of four. Each of the four subunits of each bundle interacts with a different subunit from a neighbouring bundle, such that 12 dimers are formed. The overall network of interactions leads to multimerization. According to the model, each of the six bundles of globular domains is positioned at the corners of an imaginary octahedron and the helical C-terminal segments are oriented towards the centre of the particle. The edges of the octahedron represent the dimeric contacts.     «

The phosphoenolpyruvte (PEP)-synthases belong to the family of structurally and functionally related PEP-utilizing enzymes. The only archaeal member of this family characterized thus far is the multimeric PEP-synthase homologue from the hyperthermophilic archaeonStaphylothermus marinus . The large protein complex was isolated from the cytosol and consists of a single type of subunits (Mr 93,7). STEM mass measurements of the complex indicated a molecular mass of 2,25±0,23 MDa. This protein comple...     »