In this thesis, three human proteins involved in the regulation of cell division and consequently in cancer, E2F-1, MDM2, and IGF-I, were investigated. The preliminary studies were carried out on protein expression and purification of the members of the E2F family. E2F-1 protein constructs in E. coli were shown to be well overexpressed but fully insoluble. The trials to optimize solubility of a GST-fused E2F-1 DNA-binding fragment were successful. The fragment of interest appeared, however, to be insoluble after GST cleavage. Attempts to purify and refold the insoluble histidine-tagged full length E2F-1 resulted in the pure and soluble, however unfolded polypeptide as shown by NMR spectroscopy. Additional studies showed that baculovirus expression vectors system could be an other way of producing the biologically active and properly folded protein. The NMR work carried out in this thesis showed that chalcones (1,3-diphenyl-2-propen-1-ones) are MDM2 inhibitors that bind to a subsite of the p53 binding cleft of human MDM2. Biochemical experiments showed that these compounds can disrupt the MDM2/p53 protein complex, releasing p53 from both the p53/MDM2 and DNA-bound p53/MDM2 complexes. These results thus offer a starting basis for structure-based drug design of cancer therapeutics. This thesis presents the 2.1 Å crystal structure of the complex of IGF-I bound to the N-terminal IGF-binding domain of IGFBP-5 (mini-IGFBP-5), a prototype interaction for all N-terminal domains of the IGFBP family. The principal interactions in the complex comprise interlaced hydrophobic side chains that protrude from both IGF-I and the IGFBP-5 fragment and a surrounding network of polar interactions. A solvent-exposed hydrophobic patch is located on the IGF-I pole opposite to the mini-IGFBP-5 binding region and marks the IGF-I receptor binding site. The structure led to the design of small organic compounds that were shown to disrupt the binding of IGFBP-5 to IGF-I, thus, providing starting leads for therapeutics that could influence the regulation of the IGF-IGFBP axis.     «

In this thesis, three human proteins involved in the regulation of cell division and consequently in cancer, E2F-1, MDM2, and IGF-I, were investigated. The preliminary studies were carried out on protein expression and purification of the members of the E2F family. E2F-1 protein constructs in E. coli were shown to be well overexpressed but fully insoluble. The trials to optimize solubility of a GST-fused E2F-1 DNA-binding fragment were successful. The fragment of interest appeared, however, to b...     »

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden drei humane Proteine E2F-1, MDM2, IGF-I, die an der Regulierung der Zellteilung und dadurch an der Krebsentstehung beteiligt sind, untersucht. Einleitende Studien zur Expression und Reinigung von Proteinen der E2F-Familie wurden durchgeführt. Verschiedene Konstrukte von E2F-1 wurden in E. coli in hoher Ausbeute aber vollkommen unlöslich exprimiert. Versuche zur Erhöhung der Löslichkeit eines mit GST fusionierten und DNA-bindenden Fragments von E2F-1 waren erfolgreich. Nach enzymatischer Entfernung von GST erwies sich das Fragment als unlöslich. Versuche zur Reinigung und Rückfaltung des vollständigen, mit Hexahistidin-Tag fusionierten, E2F-1 führten zu einem sehr reinen und löslichen Polypeptid, das laut NMR-Spektroskopie keine Faltung aufwies. Weiterführende Studien zeigten, dass das Baculovirusexpressionsvektorsystem eine Alternative zur Produktion von biologisch aktivem Protein darstellt. Die Untersuchungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie in der vorliegenden Arbeit zeigten, dass Chalcone (1,3-diphenyl-2-propen-1-one) in einem bestimmten Bereich der p53-Bindetasche des humanen MDM2 binden können. Biochemische Experimente bewiesen die Fähigkeit dieser Verbindungen, p53 aus p53/MDM2-Komplexen und aus an DNA gebundenen p53/MDM2-Komplexen freizusetzen. Diese Ergebnisse bieten die Grundlage für die Entwicklung neuer Wirkstoffe in der Krebstherapie. Die Kristallstruktur des Komplexes zwischen IGF-I und der N-terminalen IGF-Bindungsdomäne von IGFBP-5 (mini-IGFBP-5) wurde mit einer Auflösung von 2,1 Å aufgeklärt. Diese Wechselwirkung mit IGF-I ist typisch für alle N-terminalen Domänen der IGFBP-Familie. An den grundlegenden Wechselwirkungen sind ineinander verflochtene hydrophobe Seitenketten, die aus beiden Komplexpartnern herausragen und ein umgebendes Netzwerk aus polaren Interaktionen, beteiligt. Eine zum Solvenz hin exponierte hydrophobe Region befindet sich am zur IGFBP-5-Bindestelle entgegengesetzten Ende und markiert die Bindestelle des IGF-I-Rezeptors. Die Struktur führte bereits zur Entwicklung von kleinen organischen Molekülen, die in der Lage sind die Assoziation von IGBP-5 an IGF zu unterbinden. Dies eröffnet die Möglichkeit für therapeutische Ansätze zur Regulation des IGF/IGFBP-Systems.     «

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden drei humane Proteine E2F-1, MDM2, IGF-I, die an der Regulierung der Zellteilung und dadurch an der Krebsentstehung beteiligt sind, untersucht. Einleitende Studien zur Expression und Reinigung von Proteinen der E2F-Familie wurden durchgeführt. Verschiedene Konstrukte von E2F-1 wurden in E. coli in hoher Ausbeute aber vollkommen unlöslich exprimiert. Versuche zur Erhöhung der Löslichkeit eines mit GST fusionierten und DNA-bindenden Fragments von E2F-1 waren erf...     »