Sequence-dependence in intein mediated protein trans-splicing reactions and Function and structure of the Type VI CRISPR nuclease Cas13a from Rhodobacter capsulatus
Übersetzter Titel:
Sequenz-Abhängigkeit in Intein-basierten Protein-trans-Spleiß-Reaktionen und Funktion und Struktur der Type VI CRISPR Nuklease Cas13a aus Rhodobacter capsulatus
Schneider, Sabine (Dr.); Sattler, Michael (Prof. Dr.)
Sprache:
en
Fachgebiet:
CHE Chemie
TU-Systematik:
CHE 800d
Kurzfassung:
Structural and functional knowledge of biomolecules is a prerequisite for biotechnological applications. In this thesis, investigations on two different projects were made to provide structural and mechanistical understanding of the reactions involved by biochemical and X-ray crystallographic methods. First, the sequence-dependence of intein splice reactions on the sequence of the extein was studied using SICLOPPS constructs for production of cyclic peptides. Second, the mechanism and function of the type VI CRISPR nuclease Cas13a from Rhodobacter capsulatus was investigated.
Cyclic peptides (CPs) are currently booming in pharmaceutical applications due their pharmacologically superior properties compared to linear peptides. One of the most utilised methods for CP production, SICLOPPS, combines the strength of CPs with the possibility of creating genetically encoded libraries. In this intein-based method, nearly all residues of the hexameric cyclic peptides that correspond to the exteins of standard intein splicing, have consequences on splicing. This consequence has not been studied before intensively. In the first part of this thesis, clear differences in cyclic peptide yield and production efficiency could be seen for varying amino acids at positions CP+2 and CP+3, espcially when using a phenylalanine at one of these two position, and for the two different inteins DnaE orthologues from Synechocystis sp. PCC6803 and Nostoc punctiforme. A direct link between sequence and yield could not be drawn from the first structures of intein pre-splice complexes due to crystal contacts of the cyclic peptides. However, the importance of a conserved aspartate could be strengthened by the structures. Additionally, the first intermediate of the ’capture-and-collapse’ mechanism of split intein folding was found and thus able to confirm this hypothesis.
The use of Class 2 CRISPR nucleases for biotechnological purposes, e.g. genome editing, is constantly increasing. For the discovery of new techniques, charaterisation of novel nucleases plays an equally important role as engineering of known nucleases. The goal of the second part of this thesis was the investigation of the type VI-A nuclease Cas13a from Rhodobacter capsulatus, which is upregulated upon cellular stress, and knockouts of which , although not lethal, show severe growth restrictions. In the context of this work, molecular biological, biochemical and X-ray crystallographic methods were employed to gain insights in the molecular mechanism and function. It could be shown that Cas13a is able to process its own pre-crRNA and sequence-specific activities of Cas13a could be demonstrated. Finally, the 2.2 Å structure of Cas13a in complex with crRNA could be solved by X-ray crystallography. Here, it became clear that crRNA binding occurs via shape-recognition only and that active site assembly requires binding of allosterically acting target RNA. Thus, the first hypothesis of the reaction mechanism could be proposed based on the structure of the Rhodobacter capsulatus Cas13a and homologous structures.
Übersetzte Kurzfassung:
Wissen über Struktur und Funktion von Biomolekülen ist eine Grundlage für biotechnologische Anwendungen. In dieser Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen Projekten mittels biochemischer und Röntgen-kristallographischer Methoden durchgeführt, um strukturelles und mechanistisches Verständnis der beteiligten Reaktionen zu erlangen.
Zyklische Peptide (ZPs) erleben aktuell einen pharmazeutischen Aufschwung aufgrund ihrer pharmakologisch überlegenen Eigenschaften gegenüber linearen Peptiden. Eine der am häufigsten benutzten Methoden zur Produktion von ZPs, SICLOPPS, kombiniert die Stärke von ZPs mit der Möglichkeit, genetisch codierte Bibliotheken zu erstellen. Bei dieser Intein-basierten Methode haben fast alle Aminoäuren der hexamerischen zyklischen Peptide, die den Exteinen im normalen Intein-Spleißen entsprechen, Auswirkung auf das Spleißen. Diese Auswirkungen wurden aber noch nicht intensiv untersucht. Im ersten Teil dieser Dissertation konnten deutliche Unterschiede in der Ausbeute und Produktionseffizienz von zyklischen Produkten beobachtet werden bei unterschiedlichen Aminosäuren an den Positionen ZP+2 und ZP+3, insbesodere, wenn an diesen Positionen ein Phenylalanin benutzt wurde, sowie mit den zwei verschiedenen DnaE Intein-Orthologen aus Synechocystis sp. PCC6803 und Nostoc punctiforme. Eine direkte Verbindung zwischen Sequenz und Ausbeute konnte aus den ersten Strukturen von prä-Spleiß-Komplexen nicht gezogen werden, da die zyklischen Peptide in Kristallkontakten eingebettet waren. Allerdings konnte die Wichtigkeit eines konservierten Aspartats durch die Strukturen verstärkt werden. Außerdem konnte der erste Übergangszustand des ”capture-and-collapse”-Mechanismus der Split-Intein-Faltung gefunden und so diese Hypothese bestätigt werden.
Der Einsatz von Klasse 2 CRISPR-Nukleasen für biotechnologische Zwecke, wie zum Beispiel Genom-Editierung, steigt konstant. Um neue Techniken zu entdecken, spielt die Charakterisierung noch unbekannter Nukleasen ebenso eine Rolle wie das Engineering von bereits bekannter Nukleasen. Ziel des zweiten Teils dieser Dissertation war die Untersuchung der Typ VI-A Nuklease Cas13a aus Rhodobacter capsulatus, die bei zellulärem Stress hochreguliert wird, und deren Knockout, wenngleich nicht lethal, schwere Wachstumsstörungen erzeugt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden molekularbiologische, biochemische und Röntgen-kristallographische Methoden eingesetzt, um Einblicke in den molekularen Mechanismus und die Funktion zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass Cas13a in der Lage ist, seine prä-crRNA zu prozessieren und sequenz-spezifische Aktivitäten von Cas13a konnten demonstriert werden. Schlussendlich konnte die 2.2 Å Struktur von Cas13a im Komplex mit crRNA mittels Röntgen-Kristallographie bestimmt werden. Hier wurde klar, dass Bindung von crRNA ausschließlich durch Erkennung der Form passiert und dass Assemblierung der aktiven Tasche die Bindung von allosterisch wirkender target RNA. So konnte die erste Hypothese des Reaktionsmechanismus, basierend auf der Struktur von Rhodobacter capsulatus Cas13a und homologen Strukturen, vorgeschlagen werden.
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