Im Zuge der funktionellen Charakterisierung der Hepatitis B Oberflächenproteine wurde in der PreS2-Region ein Bereich entdeckt, der zellpermeable Eigenschaften aufweist. Dieses Motiv wird als Translokationsmotiv (TLM) bezeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Aspekte des TLM untersucht: Zum einen konnten durch die Fusion des TLM mit Kapsiden des Hepatitis B Virus, zellpermeable Kapsid-Partikel als ein neues Werkzeug zum Gen- und Proteintransfer etabliert werden. Zum anderen wurde in dieser Arbeit die Bedeutung des TLM für den Lebenszyklus des HBV untersucht. Zur Vermittlung der Zellpermeabilität der Kapsid-Partikel des HBV, ist die Exposition des TLM auf der Oberfläche des Kapsides essentiell. Dazu wurde das TLM zum einen N-terminal über einen 14 Aminosäuren langen Linker und zum anderen in eine als spike tip bezeichnete Region innerhalb des Kapsid-Proteins eingebracht. Die Fähigkeit der Kapside, biologische Membranen zu überwinden wurde durch Inkubation von immortalisierten adhärenten Zelllinien, sowie von primären, dendritischen Zellen mit Hilfe der Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Des weiteren wurde versucht, zum einen im prokaryontischen als auch im eukaryontischen System spezifisch Nukleinsäure in die Kapside zu verpacken. Hierfür wurde im prokaryontischen System hergestellte Partikel in einem ersten Schritt durch Denaturierung in Proteindimere getrennt. In einem zweiten Schritt wurden die denaturierten Proteine in Gegenwart von zu verpackender DNA renaturiert, wodurch es zur Integration der DNA in das entstehende Kapsid kam. Ausgehend von einem 1,2fachen HBV-Genom des Subtyps adr4, wurden durch ortsgerichtete Mutagenese vier Basen innerhalb der für das TLM kodierenden Region ausgetauscht, wodurch die Amphiphilie dieses Bereiches drastisch verändert wurde. Durch Strukturberechnungen konnte gezeigt werden, dass darüber hinaus die Mutationen zu einem Verlust der für die Zellpermeabilität verantwortlichen alpha-helikalen Bereiches führen. Da in Transfektionsexperimenten gezeigt werden konnte, dass die Zerstörung des TLM keinen Einfluss auf die Produktion der viralen Proteine, sowie der Sekretion und Reifung der Viruspartikel hat, konnte auf diese Weise ein System zur Herstellung TLM defizienter Viren etabliert werden. Damit ist es möglich die Rolle des TLM für den Infektionsvorgang in etablierten Infektionssystemen zu untersuchen.     «

Im Zuge der funktionellen Charakterisierung der Hepatitis B Oberflächenproteine wurde in der PreS2-Region ein Bereich entdeckt, der zellpermeable Eigenschaften aufweist. Dieses Motiv wird als Translokationsmotiv (TLM) bezeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Aspekte des TLM untersucht: Zum einen konnten durch die Fusion des TLM mit Kapsiden des Hepatitis B Virus, zellpermeable Kapsid-Partikel als ein neues Werkzeug zum Gen- und Proteintransfer etabliert werden. Zum anderen wurde in dieser...     »

In the course of the functional characterization of hepatitis B surface proteins, a motif with cell permeable properties was discovered within the PreS2 region termed translocation motif (TLM). In this context two aspects of TLM were investigated. First we established a TLM fusion protein with hepatitis B virus core to generate cell permeable capsid particles as a novel tool for gene and protein transfer. Moreover we characterized the significance of TLM in the life cycle of the hepatitis B virus. For mediating cell permeability of HBV capsid particles, it is essential for TLM to be exposed on the shell surface, so that it is easily accessible. For that purpose on the one hand the TLM was introduced at the N-terminus via a 14 amino acid linker, on the other hand the TLM was inserted into a region of the core protein designated as spike tip. The ability of the particles to penetrate biological membranes was shown by incubation of immortalized adherent cells and primary dendritic cells with the different constructs and subsequent immunofluorescence microscopy. Furthermore, we tried to package specific nucleic acids into the modified capsids in two different approaches, using a prokaryotic as well as a eukaryotic expression system. In the first step of the prokaryotic approach, capsids were denatured to obtain core protein dimers. Consecutively the denatured proteins were renatured in the presence of the DNA of interest, yielding capsids with integrated DNA. To mimic the viral mechanism for RNA integration into core particles, we triple-transfected eukaryotic cells with expression constructs coding for the core protein, the viral polymerase and a packaging transcript. Particle assembly was confirmed by sucrose density gradient analysis. Generation of hepatitis B viral particles mutated in the TLM Using a HBV subtype adr4 genome, we introduced mutations in the TLM coding region by site-directed mutagenesis, leading to an alteration of the hydropathy profile as well as disruption of the alpha-helix formation as suggested by computer aided structure prediction. Transfection experiments with these constructs showed, that the mutation of TLM does neither impair the expression of viral proteins nor the secretion and maturation of viral particles. By this means, we were able to establish a system for the generation of TLM deficient particles, to investigate role of this motif for the viral life cycle.     «

In the course of the functional characterization of hepatitis B surface proteins, a motif with cell permeable properties was discovered within the PreS2 region termed translocation motif (TLM). In this context two aspects of TLM were investigated. First we established a TLM fusion protein with hepatitis B virus core to generate cell permeable capsid particles as a novel tool for gene and protein transfer. Moreover we characterized the significance of TLM in the life cycle of the hepatitis B viru...     »