Ein Ziel der molekularen Strukturbiologie ist die Bereitstellung
eines Proteinatlas, der Information über die räumliche Anordnung,
die Konzentration und die Interaktionen von Proteinkomplexen in
ihrer natürlichen ungestörten Umgebung enthält. Da nur im zellulären
Kontext die Funktionen und die zugrunde liegenden Mechanismen,
welche das Zusammenspiel der Makromoleküle steuern, verstanden
werden können, benötigt man möglichst wenig-invasive
Untersuchungsmethoden mit einer Auflösung im Nanometerbereich. Die
zelluläre Kryo-Elektronentomographie ist momentan die einzige
Abbildungstechnik, die es ermöglicht, dreidimensionale (3D)
hochaufgelöste Einblicke in die supramolekulare Architektur von
vitrifizierten Zellen in toto zu geben.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden intakte Zellen des
Archaeons Thermoplasma acidophilum mittels
Kryoelektronentomographie untersucht mit dem Ziel, einen
makromolekularen Atlas der Zelle zu erstellen.
Ein limitierender Faktor in der Elektronentomographie sind
die Abmessungen des zu untersuchenden Objektes in
Durchstrahlungsrichtung. Zudem reduziert die intrinsisch hohe
Proteindichte im Cytoplasma (Macromolecular Crowding) den
Bildkontrast, was die Identifikation einzelner Makromoleküle in der
Rekonstruktion mit dem momentanen Stand der Technik erschwert bzw.
unmöglich macht. Deshalb wurde T. acidophilum bei
unterschiedlichen Wachstumsbedingungen kultiviert, um die
geeignetste Morphologie für die tomographische Datenaufzeichnung und
nachfolgende Mustererkennung zu finden. Es wurden anaerobe
Bedingungen gefunden, unter denen sich zum Teil besonders flache
Zellen ausbildeten. Bei diesen Studien wurden in mehreren
Tomogrammen von T. acidophilum Bündel von Filamenten
innerhalb der Zelle beobachtet. Datenbanksuchen lieferten einige
potentielle Kandidaten im Genom von T. acidophilum, die
solche filamentöse Strukturen ausbilden könnten. Unter anderem auch
das Protein Ta0583, ein archaeales Aktin-Homolog, welches mittels
Elektronenmikroskopie und Röntgenstrukturanalyse weiter
charakterisiert wurde. T. acidophilum bietet sich als Modellsystem an, um
mittels Kryo-Elektronentomographie und Mustererkennung die
makromolekulare Architektur der Zelle zu untersuchen, da bereits
mehrere Proteinstrukturen aus diesem Organismus bekannt sind und
zusätzliche Informationen aus Genom- und Proteomanalyse verfügbar
sind. Mit Hilfe der Free-Flow Elektrophorese wurden
cytoplasmatische Proteine aus T. acidophilum, gemäß ihres
isoelektrischen Punktes in zahlreiche Fraktionen aufgetrennt und
anschließend elektronenmikroskopisch und massenspektrometrisch
charakterisiert. Mit dieser Vorgehensweise wurde ein in T.
acidophilum noch unbekannter hochmolekularer Proteinkomplex, die
Ornithin Transcarbamoylase, gefunden. Dieser Proteinkomplex, bzw.
die Struktur des homologen Proteins aus Pyrococcus furiosus,
sowie das 70S Ribosom, das Thermosom und drei Proteasen (20S
Proteasom, Tricorn und VAT) wurden mit Hilfe eines
Mustererkennungsalgorithmus, der auf Kreuzkorrelation beruht, anhand
ihrer strukturellen Signatur im Tomogramm einer Zelle lokalisiert.
Translated abstract:
One aim of molecular structural biology is to provide a
macromolecular atlas that describes the spatial arrangements,
concentrations and interactions of specific subsets of protein
complexes in the unperturbed cellular environment. Such atlases
would be most beneficial for analysing protein interaction networks
in a cellular context. At present, cryo-electron tomography is the
only available imaging technique capable of allowing a glimpse into
the three-dimensional (3D) supramolecular architecture of vitrified
cells in toto with a resolution in the nanometre range.
In this work, intact cells of the archaeon
Thermoplasma acidophilum were investigated by cryo-electron
tomography with the objective of generating a protein atlas on a
macromolecular level.
A limiting factor for electron tomography is the size of
the investigated object. In addition, the intrinsic high protein
density within the cytoplasm ('macromolecular crowding') reduces the
image contrast, which hampers the identification of single
macromolecules in the tomographic reconstructions using
state-of-the-art techniques. For this reason, T. acidophilum
was cultured under various growth conditions to obtain the most
suitable morphology for recording tomographic data and for
subsequent template matching. Cells grown under anaerobic conditions
turned out to be particularly flat. During these studies, filaments
forming bundles inside the cell could be observed in several
tomograms. Databank searches revealed multiple potential candidates
in the genome of T. acidophilum that could be responsible for
such filamentous structures, including the protein Ta0583, an
archaeal actin homolog, which was further characterised by electron
microscopy and by X-ray crystallography. T. acidophilum is well suited as a model system to
study the macromolecular architecture of the cell with cryo-electron
tomography and pattern recognition, since several protein structures
have been solved from this organism. Other benefits include the
completely sequenced genome and ongoing proteomics studies. To carry
out structural proteomic analysis on T. acidophilum, cell
lysates were fractionated using free-flow electrophoresis. This
technique separates the cytoplasmic proteins into numerous fractions
according to their respective isoelectric points. Single fractions
were then investigated by electron microscopy and mass spectrometry.
With this approach, it was possible to identify the hitherto unknown
macromolecular protein complex ornithine carbamoyltransferase in
T. acidophilum. The structure of the homologous protein from
Pyrococcus furiosus, as well as the 70S ribosome, the
thermosome and three proteases (20S proteasome, tricorn and VAT)
were mapped inside the tomogram of an intact cell by means of a
pattern recognition algorithm based on cross correlation.
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