In the study presented, the application of FISH (Fluorescence in situ hybridisation) using different types of polynucleotide probes (classic and synthetic polynucleotide probes targeting rRNA and RINGFISH polynucleotide probes targeting DNA) and the related polynucleotide probe based enrichment technique were tested for their suitability for detection and enrichment of clinically relevant bacteria from real clinical samples. In this context, numerous developments and further evaluations of protocols had to be designed and tested: the determination of the specificity of the polynucleotide probes used, the development of protocols for an adequate permeabilisation of the cell envelopes of Gram-positive bacteria, and the development of a highly time reduced hybridisation protocol. The new developed or modified protocols and the application of the polynucleotide probe enrichment technique were primarily tested and evaluated using classic rRNA targeted polynucleotide probes on pure culture bacteria and clinical samples, which had been spiked with different target organisms. The successful application in this area enabled the further application of the protocols and the transfer of the technique to real clinical samples without artificial spiking, and allowed the successful enrichment of target bacteria from the respective real clinical samples. After integration of the protocols for Gram-positive bacteria and the evaluation of the particular hybridisation parameters regarding the RINGFISH (recognition of individual genes) polynucleotide probes designed (targeting different antibiotic resistance genes of Gram-positive and Gram-negative bacteria), the first time detection and enrichment of target cells from real clinical samples using this type of polynucleotide probes was possible. The last type of polynucleotide probes developed, synthetic polymers of specific oligonucleotide probes, could also be used successfully for detection and enrichment of bacteria from real clinical samples. The use of polynucleotide probes in the context of clinical samples could open up new doors for detection and enrichment of bacteria from complex samples and, in combination with RINGFISH polynucleotide probes, also for the detection of antibiotic resistance genes.     «

In the study presented, the application of FISH (Fluorescence in situ hybridisation) using different types of polynucleotide probes (classic and synthetic polynucleotide probes targeting rRNA and RINGFISH polynucleotide probes targeting DNA) and the related polynucleotide probe based enrichment technique were tested for their suitability for detection and enrichment of clinically relevant bacteria from real clinical samples. In this context, numerous developments and further evaluations of proto...     »

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Anwendung von FISH (Fluorescence in situ hybridisation) unter Verwendung verschiedener Arten von Polynukleotidsonden (klassischen und synthetischen Polynukleotidsonden mit den Zielmolekülen rRNA und RINGFISH Polynukleotidsonden mit Antibiotika-Resistenzgenen als Zielmolekül) im Zusammenhang mit der Polynukleotidsonden-gestützten Anreicherungstechnik auf ihre Eignung zur Detektion und Anreicherung klinisch relevanter Bakterien aus realem, klinischen Probenmaterial untersucht. Im Zuge der Anpassung der Polynukleotidsondentechnik an die untersuchten Bakterienspezies, insbesondere an Gram-positive Bakterien und reales, klinisches Probenmaterial, mussten eine Reihe von neuen Protokollen als auch Adaptionen bereits existierender Protokolle entwickelt und evaluiert werden: die Bestimmung der Spezifität der verwendeten Sonden, die Entwicklung von Protokollen zur angemessenen Permeabilisierung der Zellhülle Gram-positiver Bakterien, sowie die Entwicklung eines zeitreduzierten Hybridisierungsprotokolls. Die neu entstandenen Protokolle als auch die Anwendbarkeit und der Transfer der Technik wurden beginnend mit klassischen rRNA zielgerichteten Polynukleotidsonden an Reinkulturen von Bakterien und künstlich mit Zielbakterien versetztem klinischem Probenmaterial evaluiert. Die erfolgreiche Anwendung in diesem Bereich erlaubte die Ausweitung und Übertragung der Technik auf reales klinisches Probematerial, das nicht künstlich mit Zielbakterien versetzt war. Auch die entwickelten RINGFISH (recognition of individual genes) Polynukleotidsonden, zielgerichtet auf verschiedene Antibiotika-Resistenzgene Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, konnten nach Integration der Protokolle für Gram-positive Bakterien sowie Evaluierung der speziellen Hybridisierungsbedingungen zum ersten Mal zur Detektion und Anreicherung von Zielbakterien aus realem, klinischen Probenmaterial verwendet werden. Synthetische Polynukleotidsonden, zielgerichtet auf rRNA und bestehend aus repetetiven Sequenzen spezifischer Oligonukleotidsonden, konnten ebenfalls exemplarisch die Anwendbarkeit im Rahmen der Anreicherung von Zielzellen aus realem, nicht künstlich mit Zielbakterien versetztem Probenmaterial zeigen. Die Verwendung von Polynukleotidsonden im Zusammenhang mit klinischem Probenmaterial könnte eine weitere Methode darstellen, Zielbakterien in komplexem Proben zu detektieren, anzureichern und gegebenenfalls in Kombination mit RINGFISH Polynukleotidsonden eine Bestimmung von vorliegenden Antibiotika-Resistenzgenen zu erlauben.     «

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Anwendung von FISH (Fluorescence in situ hybridisation) unter Verwendung verschiedener Arten von Polynukleotidsonden (klassischen und synthetischen Polynukleotidsonden mit den Zielmolekülen rRNA und RINGFISH Polynukleotidsonden mit Antibiotika-Resistenzgenen als Zielmolekül) im Zusammenhang mit der Polynukleotidsonden-gestützten Anreicherungstechnik auf ihre Eignung zur Detektion und Anreicherung klinisch relevanter Bakterien aus realem, klinischen Probenmateri...     »