The work presented here deals with in situ hybridisation techniques using polynucleotide probes and applications thereof. Fluorescence in situ hybridisation (FISH) using rRNA targeted oligonucleotide probes is a standard method for identification of microorganisms in environmental samples. A few years ago polynucleotide probes (generated via in vitro transcription) were introduced, which are superior to oligonucleotide probes regarding their signal intensity, thus allowing the detection of organisms with a low number of ribosomes. One characteristic feature of hybridisations with polynucleotide probes is the so called "halo", i.e. a concentration of the fluorescence signal in the cell periphery. In the first stage of this work several parameters of the hybridisation with polynucleotide probes, such as cell fixation, stringency, length and secondary structure of the probes were explored and optimised. Furthermore the method was applied to several organisms differing in the structure of their cell envelope (i.e. gram-positive and gram-negative bacteria, yeasts and mammalian cell lines). With the insights gained from these analyses a hypothesis was postulated that explains the origin and nature of the characteristic halo signal and has important implications for future probe design. This "network hypothesis" was supported by various control experiments. On the basis of this hypothesis it was possible to develop polynucleotide probes targeting plasmids and even chromosomal DNA – target molecules that have previously been thought to be absolutely unsuitable for detection with in situ hybridisation due to their low copy number. This modified FISH technique now for the first time permits the detection of individual genes in single cells in situ and has therefore been termed RING-FISH (recognition of individual genes). In combination with classic rRNA targeted oligonucleotides this method offers a wide range of possible applications, including the analysis of metabolic activity of certain species within a bacterial community or the detection of horizontal gene transfer. In the second stage of this work an existing method for cell sorting, which is based on polynucleotide probe mediated immobilisation of cells, was advanced and optimised. The method was tested with rRNA as well as plasmid and DNA targeted probes and might prove useful in the isolation of new members of a gene family if conserved domains of a gene are used as probe target.     «

The work presented here deals with in situ hybridisation techniques using polynucleotide probes and applications thereof. Fluorescence in situ hybridisation (FISH) using rRNA targeted oligonucleotide probes is a standard method for identification of microorganisms in environmental samples. A few years ago polynucleotide probes (generated via in vitro transcription) were introduced, which are superior to oligonucleotide probes regarding their signal intensity, thus allowing the detection of organ...     »

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit in situ Hybridisierungstechniken für fluoreszenz-markierte Polynukleotidsonden und deren mögliche Anwendungen. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit rRNA gerichteten Oligonukleotidsonden ist eine bewährte Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen in Umweltproben. Vor einigen Jahren wurden erstmals auch (durch in vitro Transkription generierte) Polynukleotid-sonden verwendet, die den Oligonukleotisonden in punkto Signalintensität überlegen sind und somit auch eine Detektion von Organismen mit niedriger Ribosomenzahl gestatten. Ein charakteristisches Merkmal von Hybridisierungen mit Polynukleotidsonden ist die Ausbil-dung eines sogenannten "Halos", d.h. eine Konzentration des Fluoreszenzsignals in der Zellperipherie. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst verschiedene Parameter der Hybridisierung mit Polynukleotidesonden, wie Zellfixierung, Stringenz der Hybridisierung, sowie Länge und Sekundärstruktur der Sonden untersucht und optimiert und die Methode mit einigen Organis- men, die sich im Aufbau ihrer Zellhülle stark unterscheiden (grampositive und -negative Bakterien, Hefen, Säugetierzellen), getestet. Anhand dieser Erkenntnisse wurde eine Hypo-these formuliert, die die Ausbildung des charakeristischen Halos erklärt und weitreichende Implikationen für die weitere Entwicklung von Sonden hat. Diese "Netzwerk"-Hypothese konnte durch verschiedene Kontrollexperimente unterstützt werden. Basierend auf dieser Hypothese war es möglich, Polynukleotidsonden zu entwickeln, die gegen Plasmide und sogar chromosomale DNA gerichtet sind, Zielmoleküle, die bisher auf-grund ihrer niedrigen Kopienzahl als gänzlich ungeeignet für eine Detektion mittels in situ Hybridisierung galten. Diese modifizierte FISH-Methode gestattet nun erstmals den in situ Nachweis eines spezifischen Gens in einer einzelnen Zelle und wird deshalb als RING-FISH (recognition of individual genes) bezeichnet. In Kombination mit klassischen rRNA gerichteten Oligonukleotidsonden bietet die Methode ein breites Anwendungsspektrum, wie z.B. die Aufklärung der Stoffwechselfunktion einzelner Spezies in einer komplexen Bakterienpopulation oder den Nachweis von horizontalem Gentransfer. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine bereits bestehende Methode zur Zellsortierung, die sich auf eine durch Polynukleotidsonden vermittelte Immobilisierung von Zellen stützt, weiterentwickelt und optimiert. Die Methode wurde, zusätzlich zu rRNA- , auch mit Plasmid- und DNA-gerichteten Sonden getestet und könnte, bei Verwendung von konservierten Domänen als Sondenziel, Anwendung finden bei der Isolierung neuer Mitglieder einer Genfamilie.     «

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit in situ Hybridisierungstechniken für fluoreszenz-markierte Polynukleotidsonden und deren mögliche Anwendungen. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit rRNA gerichteten Oligonukleotidsonden ist eine bewährte Methode zur Identifizierung von Mikroorganismen in Umweltproben. Vor einigen Jahren wurden erstmals auch (durch in vitro Transkription generierte) Polynukleotid-sonden verwendet, die den Oligonukleotisonden in punkto Signalintensität überlegen sind...     »