In dieser Doktorarbeit wurden zwei Projekte durchgeführt. Das erste behandelt Untersuchungen der Funktion des Retinoblastoma Proteins und seiner Wechselwirkung mit Bindungspartnern. Das zweite Projekt beschreibt die Charakterisierung von funktionalen Domänen des humanen BRG1 Proteins und die Bestimmung der 3D Struktur der BRG1 Bromodomäne. Das Retinoblastoma Tumor Suppressor Protein (pRb) ist ein negativer Schlüsselregulator der Zellproliferation, der häufig in menschlichen Tumoren dereguliert ist. Von mehr als 130 Proteine wurde eine direkte Bindung an pRb nachgesagt. Viele dieser Wechselwirkungen sind mit der kleinen Pocket Domäne von pRb, welche die A und B Cyclin-ähnlichen-Domänen (AS 379-578 und 641-791) umfasst, in der bevorzugt Mutationen auftreten, die bei der Krebsentstehung beobachtet wurden. Jedoch sind die Ergebnisse in der Literatur teilweise zweideutig und widersprüchlich. Wir haben einige dieser Interaktionen an gereinigten Proteinen mit verschiedenen Methoden, darunter in-vitro biophysikalische und biochemische Methoden wie Kern Spin Resonanz Spektroskopie (NMR), Massenspektrometrie, Isotermale Titrations Calorimetrie (ITC), Affinitäts-Chromatographie pull-down Experimente und Gelfiltrations Chromatographie getestet. Mit Hilfe dieses Ansatz wurden folgende Interaktionspartner von pRb untersucht: MyoD, Id-2, E2F1, HDAC1, PAI2, HPV E7, SV40 large T Antigen, hBRG1, und Gankyrin. Die Muskelzelldifferenzierung fördernde Faktoren wie MyoD und inhibierende Faktoren wie Id-2, wurden als Interaktionspartner der kleinen Pocket Domäne von pRb beschrieben, die durch direkte Wechselwirkung mit pRb das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung während der Myogenese steuern. Es gib aber widersprüchliche Angaben zu einer direkten Wechselwirkung zwischen pRb einerseitz und MyoD bzw. Id-2 andererseits. Wir überprüften die Interaktion mit dem Multimethoden Ansatz in vitro. Mit diesem Ansatz konnte wir zeigen, dass es direkte Interaktionen zwischen pRb und HPV E7, pRb und SV40 large T Antigen, MyoD und DNA sowie MyoD und Id-2 gibt. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir zweifelsfrei zeigen, dass es keine direkte Wechselwirkung zwischen der kleinen Pocket Domäne von pRb und der bHLH Domäne von MyoD sowie zwischen der kleinen Pocket Domäne von pRb und Id 2 gibt. Indirekte Wechselwirkung über weitere Bindungspartner in einem Multiproteinkomplex oder die Modulation der Genexpression sind daher die wahrscheinlicheren Aktionen. Viele virale Onkoproteine (wie z.B.: HPV E7, E1A) binden an die kleine Pocket Domäne von pRb über ihr LXCXE Bindungsmotiv. Es wurde ebenfalls von ca. 20 zelluläre Proteine, die ein LXCXE Motiv haben, berichtet, dass sie mit der kleinen Pocket Domäne von pRB assoziiert sind. Mit Hilfe von in vitro Methoden wie NMR und ITC konnte ich zeigen, dass die LXCXE Peptide von viralen Onkoproteinen stark an die kleine Pocket Domäne von pRb binden. Zusätzlich habe ich gezeigt, dass das LXCXE ähnliche Peptid der Histon Deacetylase 1 (HDAC1) an die gleiche Bindungsstelle an pRb bindet, jedoch mit einer schwächeren (im micromolaren Bereich) und transienten Bindung. Systematischer Ersatz von Aminosäureresten außer den konservierten Resten L, C und E zeigte, dass die flankierende Reste des LXCXE Motivs wichtig für die Bindung an pRb sind. Positiv geladene Reste in der XLXCXEXXX Sequenz schwächen die Bindung signifikant. Ich konnte ebenfalls zeigen, dass die intramolekularen Wechselwirkungen in den LXCXE Peptiden wichtig sind um die Aminosäuren für eine optimale Orientierung für die Bindung an pRb auszurichten. Das BRG1 Protein ist die zentrale, konservierte ATPase der humanen SWF/SNF Klasse von ATP abhängigen Chromatin-Remodulierenden Komplexen. Das humane BRG1 Protein hat eine ATPase Domäne, ein AT-hook Region und eine Bromodomäne. Ein AT-hook Motiv, ein DNA Bindungsmotiv, wurde erstmals in der high-mobility-group des Nicht-Histon chromosomalen Proteins HMGA 1/2 (auch HMGI/Y genannt) gefunden. Die Bromodomäne ist eine Acetyllysin erkennende Domäne, die in vielen Chromatin assoziierten Proteinen vorkommt. Das AT-hook Motiv bindet unspezifisch an die kleine Furche in AT reiche DNA Sequenzen von B DNA. In dieser Arbeit habe ich ein Fragment von hBRG1, welche die AT-hook Region und die Bromodomäne umfassten, kloniert und gereinigt. NMR und CD Spektroskopie zeigten, dass die rekombinante Domäne gefaltet in Lösung vorliegt. Die Funktion der Subdomäne wurde durch Interaktionsstudien mit N Acetylierten Peptiden von Histonen überprüft. Ebenso habe ich die AT-hook Region auf ihre DNA Bindung charakterisiert und ITC Daten zeigten, dass die Hauptinteraktion mit DNA über das AT-hook Motiv geht. Das AT-hook Motiv interagiert mit linearer DNA indem es sie aufwindet. Diese Eigenschaften gleichen den Charakteristika des HMGA 1/2 Proteins und dessen Interaktion mit DNA. Die BRG1 und BRM1 ATPase Untereinheiten des SWI/SNF Komplex beinhalten auch eine Bromodomäne am C-terminalen Ende des Proteins. Ich stelle im letzten Abschnitt meiner Doktorarbeit die Kristallstruktur der hBRG1 Bromodomäne bei einer Auflösung von 1.5 Å vor. Dies ist die erste Struktur einer Bromodomäne einer Untereinheit des ATP abhängigen Chromatin-Remodulierenden Komplex. Die vier Helixes in der Struktur sind ähnlich wie die Helixes in den anderen publizierten Bromodomänen der Histone Acetyltransferase (HAT) Klasse von Proteinen (GCN5, P/CAF, CBP, und dem doppel Bromodomäne Module von TAFII250), angeordnet, jedoch gibt es ein neues kleines antiparalleles β-Faltblatt (βZ-Faltblatt genannt) in der ZA loop Region der hBRG1 Bromodomäne. Sequenzvergleiche zeigten, dass dieses β Faltblatt ausschließlich in hBRG1 und hBRM1 Proteinen, wobei im Falle von hBRM1 der Bereich größer ist, vorkommt. In-silico Modelle zeigten, dass das N-Acetyllysin Peptid in gleicher Weise an die Bromodomäne von BRG1 bindet wie in den Fällen der anderen Bromodomänen andere Proteine. Jedoch ist die Bindungsfurche der BRG1 Bromodomäne größer, was eine schwächer Bindung zwischen N-Acetyllysin Peptiden und der hBRG1 Bromodomäne vermuten lässt. Diese Unterschiede in der Acetyllysin Bindungsstelle könnten das Ergebnis einer evolutionären Anpassung an die unterschiedlichen Funktionen der Bromodomänen in den verschiedenen Proteinen sein. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben ein besseres Verständnis und Bild über die Funktionen von pRb und hBRG1 in den wichtigen Prozessen der Zellzyklus Regulation und der Chromatin-Remodulierung.
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