Die Arbeit basiert auf Untersuchungen, welche in der NMR-Gruppe der Abteilung für Strukturuntersuchungen am Max-Planck-Institut für Biochemie vom Dezember 2000 bis Januar 2004 durchgeführt wurden. Zwei Projekte wurden bearbeitet: (a) die Untersuchung von Funktions- und Interaktionsmustern von bedeutenden Zellzyklus- (retinoblastoma protein (pRb) und cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)) und Zelldifferenzierungs- (MyoD und Id-2) proteinen; (b) strukturelle und dynamische Untersuchungen an den photoaktiven Proteinen GFP (green flourescent protein), CFP (cyan flourescent protein) und α-PEC (alpha-Untereinheit von Phycoerythrocyanin). Zellwachstum und Differenzierung erfordern ein präzises Zusammenspiel zwischen Zellzyklus- und Differenzierungsfaktoren. Da es eine Menge sich widersprechender Daten zur Wechselwirkung zwischen den für dieses Zusammenspiel entscheidenden Proteinen gibt, war das Ziel der Untersuchung, herauszufinden, ob die Zellzyklusproteine (pRb und CDK6) eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen mit den myogenischen differenzierungsfördernden (MyoD) bzw. hemmenden (Id-2) Faktoren haben. Wir untersuchten diese Möglichkeiten unter Verwendung von Pull-Down-Experimenten, Gel-Filtration, Massenspektroskopie, und kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR). Wir fanden heraus, dass es in vitro keine direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt. Weiterhin haben wir gezeigt, dass die C-terminale Domäne von humanem und Hühner-MyoD nicht mit humanem CDK6 wechselwirkt. Die Charakterisierung von GFP und CFP mit NMR eröffnete die Möglichkeit für Untersuchungen ihrer dynamischen Eigenschaften. Die neu eingeführte Methode der in vitro-Proteinproduktion erlaubte uns, 15N-Histidin markierte Proben von GFP herzustellen, die frei von Kreuzmarkierungen durch andere Aminosäuren waren wie sie bei der in vivo Markierung vorkommen. Mit diesen Proben konnten die Peaks ermittelt werden, die für die Wechselwirkung mit dem Chromophor wichtig sind (z.B. His148). Die 15N-HSQC NMR-Spektren der H148G GFP-Mutant, die selektiv 15N-Histidin markiert war, deuten auf die Präsenz von zwei Konformationen des Proteins, in einem langsamen gegenseitigen Austausch auf der NMR-Zeitskala, hin. Die 19F-NMR-Studien mit Varianten von GFP und CFP, die mit fluorierten Tryptophanen markiert wurden lieferten, unterstützt durch temperatur-, konzentrations- und faltungsabhängige Experimente, direkte Hinweise auf die Existenz eines langsamen Austauschprozesses zwischen zwei verschiedenen konformativen Zuständen des CFP. Die Photoisomerisierung des Holoproteins α-PEC beinhaltet eine E-Z- Isomerisierung an einer Doppelbindung im Chromophor. Während unserer Untersuchungen konnten wir beobachten, wie die verschiedenen Zustände des Chromophors die Struktur des Proteins beeinflussen. In 15N-HSQC Experimenten konnten wir Doppel-Peaks beobachten, welche die Existenz beider Konformationen E und Z in α-PEC in der 566 nm Form zeigt. (Die 566 nm Form entsteht durch Belichten des Proteins mit einer Wellenlänge von 500 nm) Weiterhin weisen unsere experimentellen Daten auf eine konformative Instabilität der E-Form hin die bei Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 577 nm entsteht. Es könnte sein, dass sowohl die E- als auch die Z-Form einen gewissen Grad an Inhomogenität bzgl. der Konformation des Proteins besitzen. Darüber geht die E-Form in einer dynamischen Veränderung aufgrund von Interkonversion in die Z-Form über. Dieser Prozess beeinflusst nicht die UV/VIS-spektroskopischen Eigenschaften der E-Form, aber er beeinflusst mit Sicherheit die Struktur des Proteins.
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Die Arbeit basiert auf Untersuchungen, welche in der NMR-Gruppe der Abteilung für Strukturuntersuchungen am Max-Planck-Institut für Biochemie vom Dezember 2000 bis Januar 2004 durchgeführt wurden. Zwei Projekte wurden bearbeitet: (a) die Untersuchung von Funktions- und Interaktionsmustern von bedeutenden Zellzyklus- (retinoblastoma protein (pRb) und cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)) und Zelldifferenzierungs- (MyoD und Id-2) proteinen; (b) strukturelle und dynamische Untersuchungen an den photoa...
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