Die in dieser Doktorarbeit vorgestellten Ergebnisse wurden in der Abteilung für Strukturforschung am Max Planck Institut für Biochemie in Martinsried erarbeitet.
Der erste Abschnitt der Arbeit beschäftigt sich vorranglich mit der strukturellen und funktionalen Charakterisierung der Interaktion zwischen Mdm2/Mdmx und p53. Der zweite Abschnitt beinhaltet die Identifikation von kleinen niedermolekularen Inhibitoren für diese Interaktion. Die Proteine Mdm2 und Mdmx sind die bedeutendsten negativen Regulatoren des Tumorsupressors p53. Die Wiederherstellung der p53 Aktivität durch die Zerrstörung der Mdm2/Mdmx Interaktion öffnet somit neue Wege in der Krebstherapie.
Die Kristallstrukturen der Komplexe zwischen wildtyp p53 Peptid und der p53- Bindungsdomäne von Mdm2 bzw. Mdmx zeigen, dass trotz der Tatsache, dass die prinzipiellen Eigenschaften der Mdm2-p53 Interaktion im Mdmx-p53 Komplex erhalten bleiben, die hydrophobe Bindungstasche, in der das p53 Peptid bindet signifikant verändert ist: Ein Teil der Bindungstasche ist durch die Seitenreste der Aminosäuren Met und Tyr blockiert. Daher sind die spezifischen Inhibitoren für Mdm2 nicht zwangsläufig optimal für die Bindung an Mdmx. Unsere Bindungsassays zeigen in der Tat, dass die potentesten Antagonisten der Mdm2-p53 Interaktion nicht in der Lage sind die Mdmx-p53 Interaktion effektiv zu unterbrechen. Um in Tumorzellen die volle Aktivität von p53 zu erreichen sind daher spezifische Antagonisten für Mdmx nötig, um die Mdm2 spezifischen Inhibitoren zu ergänzen.
In der Arbeit werden von mir zusätzlich die Kristallstrukturen von zwei Komplexen zwischen einem p53 ähnlichen mutierten Peptiden und der N-terminalen p53- Bindungsdomäne von Mdm2 bzw. Mdmx beschrieben.
Die Strukturen zeigen, dass erstens das mutierte p53-Peptid (Aminosäuresequenz: LTFEHYWAQLTS) in beiden Komplexen fast identische Konformationen annimmt (trotz der unterschiedlichen Struktur der p53 Bindungstasche in diesen zwei Proteinen), dass zweitens das Peptid eine erweiterte helicale Struktur hat im Vergleich zum Mdm2 gebunden wildtyp p53-Peptid, und dass es drittens nicht die native Faltung von Mdm2 oder Mdmx stört.
Die Erweiterung der helicalen Struktur in dem mutierten p53-Peptid verbessert die Bindung sowohl an Mdm2 als auch an Mdmx. Ein von uns entwickelter Fluorescence Polarisations Assay mit diesem Peptid zeigt dass die Bindungskonstante des mutierten Peptids zu Mdm2 bei 3,6 nM und für Mdmx bei 6,1 nM liegt. Im Vergleich dazu liegt die Bindungskonstante für die Bindung an Mdm2/Mdmx für das wildtyp Peptid mit ähnlicher Länge im unteren micromolaren Bereich.
Diese Strukturen zusammen mit dem robusten Fluorescence Polarisations Assay, sollten die Entwicklung eines einfachen Pharmakophor Modells für Inhibitoren mit einer Kreuzselektivität für Mdm2-Mdmx/p53 ermöglichen.
Der zweite Abschnitt der Arbeit beinhaltet ein NMR Screening mit niedermolekularen Verbindungen und deren Fragmenten für die Bindung an Mdm2 und Mdmx. Trotz der Bedeutung von Protein-Protein Interaktionen (PPI) für das Verständnis von elementaren Fragen für die Biologie von Krankheiten, der Intervention in deren Ursachen bzw. in deren Verlauf, bleibt die Suche und Entdeckung von niedermolekularen Verbindungen von PPI Antagonisten eines der herausfordernsten Felder der Medikamentenentwicklung. Ich beschreibe einen komplementären Ansatz für ein rationales Design von PPI Antagonisten. Diese Methode basiert auf dem engen Zusammenspiel von strukturbiologischer Information, als dem „Anker“ Konzept, virtueller und reeller multikomponenten Reaktionen (MCRs) und einem „High Content Screening“.
Durch die Anwendung dieser Methode wurden mehr verschieden Grundstrukturen für die p53/Mdm2 Interaktion gefunden als jemals vorher beschrieben wurden. Acht verschiedene Grundstrukturen mit einer anfänglichen µM Affinität für Mdm2 wurden gefunden, die als Ausgangspunkt für die medizinisch chemische Optimierung dienen können. Diese Verbindungen wurden aus über 200 Grundstrukturen herausgewählt. Die Affinität jeder dieser Verbindungen wurde mittels NMR und FP Assays abgeschätzt. Der Vorteil unserer Methode beinhaltet eine hohe Trefferquote und geringere Einbußen durch parallele Entdeckungen von multiplen Grundstrukturen, eingebaute Optimierungswege durch die Verwendung effizienter MCRs und dem schnellen Testen von computergenerierten Hypothesen.
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