Die Fourier Transform Infrarot Spektroskopie (FTIR), in Verbindung mit vollständigen mikrobiellen Referenzdatenbanken, ist für die Routineidentifizierung von Mikroorganismen den herkömmlichen Methoden überlegen.
Obwohl in einigen Studien die FTIR Methode zur Identifizierung von Mikroben verwendet wurde ist die Extrahierung komplexer Musterinformationen von mikrobiellen Infrarotspektren schwierig wenn dafür ein großer Datensatz analysiert werden muss.
Demnach benötigt es zur erfolgreichen Identifizierung von Mikroorganismen, unter Verwendung der komputerbasierten FTIR Methode, nicht nur umfangreiche Referenzdatenbanken sondern auch Datenverarbeitungsmethoden, die dazu fähig sind auch feine Informationen aus den Spektren zu extrahieren.
Thema der vorliegenden Doktorarbeit war die Anwendung der FTIR Spektroskopie um (i), unter Durchführung einer komparativen Analyse, zu analysieren welche der beiden schwingenden spektroskopischen Methoden, die FTIR-Makrospektroskopie (im Weiteren Makro-Probe genannt) oder die FTIR-Mikrospektroskopie (im Weiteren Mikro-Probe genannt), die bevorzugte Methode zur Differenzierung von Listerien auf Speziesebene ist sowie um (ii) ein neues Klassifizierungssystem, unter Verwendung einer pattern recognition Überwachungsmethode, der Künstlichen Neuronalen Netze (KNN) Analyse, für Listerien auf Speziesebene zu entwickeln, zu optimieren sowie zu validieren. Des Weiteren wurde die Leistungsfähigkeit der FTIR Methode, unter Verwendung der KNN Analysetechnik, mit der univariaten Analysemethode sowie der Standard API Differenzierungsmethode für Listerien verglichen sowie (iii) ein zusätzliches KNN, basierend auf FTIR entwickelt um L. monocytogenes Serogruppen sowie Serovaren zu identifizieren.
(i) Der erste Teil dieser Arbeit diente dem Vergleich der Makro- und Mikro-Probemethode, die zur Identifizierung von Listerien verwendet wurden. Sobald die Wachstums- und Messkonditionen erfüllt waren, wurden für diesen Zweck zwei Modelspektraldatenbanken kreiert, eine unter Verwendung der FTIR-Makro- und eine andere unter Verwendung der FTIR-Mikro-Probemethode. Bei beiden Methoden wurden 25 gut identifizierte Stämme der Arten Listerien monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri und L. welshimeri verwendet. Die Identifizierungsfähigkeit dieser Modelbibliotheken, auf Speziesebene, wurde in einer internen Validierung bestimmt. Der Vergleich der Ergebnisse erwies höhere korrekte Identifizierungswerte für die Makro- (92.8%) als für die Mikro-Probemethode (79.2%). Des Weiteren wurden die schlechtesten Ergebnisse der Mikro-Probemethode in Verbindung mit den Spezies, L. innocua, L. ivanovii und L. monocytogenes, erzielt was wiederum sowol auf die starke Beeinflussung von der Kolonienheterogenität und deren Diskriminierung als auch auf die wenniger ausgeprägten Diskriminierunsmerkmale der Mikrokolonienzellen in Wachstumphase basierte. Demnach ist die Makro-Probe die leistungsstärkere Methode.
(ii) Basierend auf den Ergebnissen des ersten Teils dieser Arbeit wurde die FTIR Makrospektroskopiemethode angewendet um ein Klassifizierungssystem für Listerien auf Speziesebene zu entwerfen. Grundlage dessen wurde eine komplexe Spektraldatenbank, welche 243 gut definierte Stämme von Listerien monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri sowie L. welshimeri enthielt. Zwei Modelle, das multivariate KNN sowie das univariate FTIR Model, wurden unter Anwendung des gleichen Referenzdatensatzes von 243 Stämmen, entwickelt. Nachdem die Parameter für die Datenanalyse optimiert waren wurde das Potential beider Modelle bewertet. Dies geschah in Form eines externen Validierungsverfahrens unter Anwendung eines Datensatzes von 277 Isolaten, welche nicht Bestandteil der Referenzdatenbank waren. Das univariate FTIR Analysemodel ermöglichte eine Identifizierung von 85,2% aller Stämme sowie 93% aller L. monocytogenes Stämme. Unter Anwendung der KNN verbesserte sich die Differenzierungsrate beträchtlich auf 96% aller Listerienarten. Die Identifizierungsrate bei den L. monocytogenes Stämmen erhöhte sich sogar auf 99,2%. Die 277 Testisolate wurden ebenfalls von dem standardphänotypischen API Listerien System identifiziert, welches 88% aller Stämme sowie 93% aller L. monocytogenes Stämme identifizierte. Anhand dieser Ergebnisse zeigte sich, dass die KNN, basierend auf FTIR, die überlegende Methode zur Identifizierung von Listerien ist. Diese Methode ermöglicht eine kostengünstige- sowie schnelle Identifizierung von Listerien, innerhalb von 25 h basierend auf Reinkulturen, und ist demnach zur Anwendung in der Routine von Lebensmittelmikrobiologielabors geeignet.
(iii) Des Weiteren wurde die FTIR Spektroskopie, in Verbindung mit KNN, auch für die Gestaltung eines Klassifizierungssystems zur Differenzierung zwischen 12 Serovaren der pathogenen L. monocytogenes verwendet. Diese basierten auf eine Datenbank von 106, gut definierten, Stämme. Die Validierung des Klassifizierungssystems wurde unter Anwendung eines Testsets bestehend aus 166 L. monocytogenes Isolaten durchgeführt. Diese ergab eine korrekte Identifizierung von 98,8% auf Serogruppen- sowie 91,6% auf Serovarebene. Hierbei gilt es zu unterstreichen, dass von 41 potentiel epidemienverursachender Stämme der Serovar 4b 40 Stämme richtig identifiziert wurden. Der Vergleich der FTIR- mit der PCR Methode zeigte, dass die FTIR Methode der PCR Methode sowie in der Identifizierung der Serogruppen als auch der Serovaren überlegen ist. Dieser Teil der Arbeit bestätigt das hohe Potential der KNN, basierend auf FTIR, zur Identifizierung von L. monocytogenes auf Spezies-, Serogruppen- und Serovarebene. Eine weitere Anwendung könnte die FTIR Methode in der Lebensmittelindustrie finden wo sie als Instrument zur Identifizierung pathogener Isolate dienen kann.
Basierend auf der Messung eines einzelnen Spektrums der unbekannten Isolate bietet die Integration des Listerien Spezies- und des Serovarklassifizierungssystems die Möglichkeit, zur gleichen Zeit, in einem Vorgang, Listerien auf Speziesebene sowie L. monocytogenes auf Serogruppen- und Serovarebene zu identifizieren.
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