Cisplatin-based chemotherapy has been deployed as the first-line therapy for advanced bladder cancer for over 30 years. However, even after the chemotherapy, the disease specific survival of patients with regional lymph node invasion or distant metastasis is still quite poor. Target therapy, which is designed to selectively inhibit the cellular molecular pathways necessary for cancer viability and progression, has been deployed as a novel therapeutic strategy in a wide range of cancer since 1990s. Unfortunately, though targeting the immune checkpoint could be a promising therapy in a small ratio of advanced BCs, so far no other target therapy has been approved by FDA or evaluated in phase III clinical trial for BC therapy. The CDK4/6-RB1-E2F pathway, which regulates the transition of cell cycle from G1 phase to S phase, is frequently disrupted in 93% of advanced bladder cancer. Our previous work has characterized the CDK4/6-RB1 pathway as a potential therapy target in BC testing the effects of CDK4/6 inhibitors in vitro and in vivo. In this project, we further studied molecular mechanisms induced by CDK4/6 inhibitor PD-0332991 and analyzed the roles of these molecules in therapy response. A prerequisite for response to CDK4/6 inhibitors was the expression of RB1, since RB1-negative cells, which were either RB1 mutant or established via RB1 knockdown, were resistant to CDK4/6 inhibition. We also observed that the therapy response of RB1-positive cell lines, T24 and RT112, to PD-0332991 correlated with a synchronous robust reduction in protein level of both total and phosphorylated RB1. The mechanism underlying the down-regulation on RB1 upon CDK4/6 inhibition was characterized next. First, we revealed a transcriptional repression on RB1 upon the treatment by RT-qPCR. Second, we observed that proteasome inhibition partially rescue the down-regulation of RB1, indicating a proteasomal degradation of RB1 upon the treatment. MDM2 was identified as a mediator that promoted the proteasomal degradation of RB1 upon CDK4/6 inhibition. Silencing of MDM2 by siRNA interfered with the degradation on RB1 and the therapy response in a time-dependent manner. Furthermore, recombinant HA-tagged wild type RB1 (RB1-WT), mutant RB1 lacking the C-terminal 42 amino acids (RB1-C42) and mutant RB1 with all CDKs phosphorylation sites mutated (RB1-CDK) were introduced into BC cells to compare their stability in response to PD-0332991. We observed that the de-phosphorylation of RB1 is not a prerequisite for its further degradation. But the MDM2-binding to RB1 is required for its degradation upon CDK4/6 inhibition. Besides, analysis on the functional and biochemical effects of prolonged CDK4/6 inhibition revealed a partial recovery of cell cycle progression and re-phosphorylation of RB1.The effects were also accompanied by a precise differential regulation on protein levels of E2F family. Overall, this work on molecular mechanisms induced by CDK4/6 inhibition raised a contradiction between two opposite observations. Therapy response correlated with a decrease of RB1, while the expression of RB1 is required for therapy response, indicating that the role of RB1 in CDK4/6 inhibition is complicated and still not thoroughly interpreted. This complexity is also consistent with the fact that RB1 is not a reliable biomarker to predict therapy response in clinical trials. Both transcriptional repression and MDM2-dependent proteasomal degradation are involved in this down-regulation of RB1 upon CDK4/6 inhibition. In addition, a partial adaptive resistance to prolonged treatment with mono-CDK4/6 inhibition is another challenge for therapy.      «

Cisplatin-based chemotherapy has been deployed as the first-line therapy for advanced bladder cancer for over 30 years. However, even after the chemotherapy, the disease specific survival of patients with regional lymph node invasion or distant metastasis is still quite poor. Target therapy, which is designed to selectively inhibit the cellular molecular pathways necessary for cancer viability and progression, has been deployed as a novel therapeutic strategy in a wide range of cancer since 1990...     »

Cisplatin basierte Chemotherapie wird seit mehr als 30 Jahren als first-line Therapie für das fortgeschrittene Blasenkarzinom angewandt. Doch trotz Chemotherapie ist das krankheitsspezifische Überleben von Patienten mit regionalem Lymphknotenbefall oder entfernten Metastasen sehr gering. Targettherapien wurden designt um spezifisch zelluläre Signalwege zu inhibieren, welche für das Überleben und die Progression eines Tumors essenziell sind. Diese Targettherapien werden seit den 1990er Jahren für verschiedene Tumorentitäten angewandt. Die Immuncheckpoint Blockade stellt einen viel versprechenden Therapieansatz für einen kleinen Anteil der Patienten mit fortgeschrittenem Blasenkarzinom dar. Jedoch wurden bisher keine weiteren Targettherapien für das Blasenkarzinom von der FDA zugelassen oder in einer klinischen Phase III Studie getestet. Der CDK4/6-RB1-E2F Signalweg, welcher den Übergang des Zellzykluses von der G1- zur S-Phase reguliert, ist in 93% der fortgeschrittenen Blasenkarzinome mutiert. In früheren Arbeiten unserer Gruppe wurde die Inhibierung des CDK4/6-RB1 Signalwegs als potentielle Therapieoption für das Blasenkarzinom identifiziert und die Effekte von CDK4/6 Inhibitoren in vitro und in vivo untersucht. In diesem Projekt wurden die molekularen Mechanismen des CDK4/6 Inhibitors PD-0332991 weiter untersucht und die Rolle dieser Moleküle auf das Therapieansprechen analysiert. Eine Voraussetzung für das Ansprechen auf CDK4/6 Inhibitoren war die Expression von RB1, da RB1 negative Zellen, welche entweder RB1 Mutationen aufwiesen oder in denen RB1 ausgeschaltet wurde, resistent gegenüber CDK4/6 Inhibitoren waren. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das Ansprechen der RB1 positiven Zellen T24 und RT112 auf PD-0332991 mit einer robusten Reduktion der Proteinexpression von RB1 und Phospho-RB1 korrelierte. Im Weiteren wurde der Mechanismus, der dieser Herunterregulation von RB1 unter CDK4/6 Inhibition zugrunde liegt, charakterisiert. Zuerst wurde mittels RT-qPCR eine transkriptionelle Repression von RB1 unter Therapie festgestellt. Als nächstes wurde beobachtet, dass die Herunterregulation von RB1 durch eine Proteasom-Inhibierung teilweise vermindert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass RB1 unter CDK4/6 Inhibition proteasomal abgebaut wird. Dabei wurde MDM2 als Mediator des proteasomalen Abbaus von RB1 unter CDK4/6 Inhibition identifiziert. Die Stilllegung von MDM2 mittels siRNA beeinflusste dabei Zeit abhängig die Degradierung von RB1 und das Therapieansprechen. Des Weiteren wurden rekombinantes HA-markiertes wild type RB1 (RB1-WT), RB1 ohne die 42 C-terminalen Aminosäuren (RB1-C42), sowie RB1 mit Mutationen in allen CDK-Phosphorylierungsseiten (RB1-CDK) in Blasenkarzinomzellen eingebracht und ihre Stabilität unter PD-0332991 Therapie verglichen. Es wurde beobachtet, dass die Dephosphorylierung von RB1 keine Voraussetzung für die weitere Degradierung war. Die MDM2-Bindung an RB1 dagegen, war nötig für die Degradierung nach CDK4/6 Inhibition. Die Analyse der funktionellen und biochemischen Effekte von verlängerter CDK4/6 Inhibition zeigten außerdem eine teilweise Erholung des Zellzyklusprogresses und eine Rephosphorylierung von RB1. Diese Effekte waren begleitet von einer präzisen, differenziellen Regulation der Proteinlevel der E2F Familie. Alles in allem weißt die vorliegende Arbeit der molekularen Mechanismen induziert durch CDK4/6 Inhibition einen Widerspruch zwischen zwei unterschiedlichen Beobachtungen auf: das Therapieansprechen korrelierte mit einer Abnahme der RB1 Expression, welche jedoch eine Voraussetzung für das Therapieansprechen war. Dies deutet darauf hin, dass die Rolle von RB1 unter CDK4/6 Inhibition kompliziert und immer noch nicht vollständig verstanden ist. In klinischen Studien zeigte sich, dass RB1 kein verlässlicher Biomarker zur Vorhersagen des Therapieansprechens ist, was die beschriebene Komplexität weiter unterstreicht. Sowohl die transkriptionelle Repression als auch die MDM2 abhängige proteasomale Degradierung sind für die Herunterregulation von RB1 unter CDK4/6 Inhibition verantwortlich. Zudem ist die partielle adaptive Resistenz gegenüber verlängerter CDK4/6 Inhibition mit Mono-CDK4/6 Inhibition eine weitere Herausforderung für die Therapie.      «

Cisplatin basierte Chemotherapie wird seit mehr als 30 Jahren als first-line Therapie für das fortgeschrittene Blasenkarzinom angewandt. Doch trotz Chemotherapie ist das krankheitsspezifische Überleben von Patienten mit regionalem Lymphknotenbefall oder entfernten Metastasen sehr gering. Targettherapien wurden designt um spezifisch zelluläre Signalwege zu inhibieren, welche für das Überleben und die Progression eines Tumors essenziell sind. Diese Targettherapien werden seit den 1990er Jahren für...     »