Das p53 Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der als der wichtigste Tumorsuppressor in Säugern fungiert und in mehr als 50% aller humanen Tumoren mutiert ist. p53 reguliert die Expression einer Reihe von Genen, die eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, der Anti-Angiogenese, der Apoptose und der Seneszenz spielen. Aufgrund seiner zentralen Rolle bei der Verhinderung der Tumorentstehung haben therapeutische Ansätze zur Reaktivierung der p53 Funktion in Tumorzellen großes Interesse gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein effizientes System zur In-Vitro-Faltung und Reinigung der p53 DNA-Bindungsdomäne (DBD) etabliert. Anschließend wurde die p53 DBD umfassend biochemisch, biophysikalisch und strukturell im Vergleich zu verschiedenen p53 Deletionsmutanten charakterisiert. Im Verlauf dieser Arbeit wurde gezeigt, daß grundlegende Voraussetzungen des allosterischen Modells der p53 Regulation, das eine Interaktion der C-terminalen Domäne mit der DNA-Bindungsdomäne von p53 postuliert, nicht zutreffen. Vielmehr unterstützen die Ergebnisse Modelle, die auf einer Interaktion der C-terminalen Domäne mit unspezifischer DNA beruhen. NMR-spektroskopische Untersuchungen ermöglichten erstmals die experimentelle Lokalisation der Reste, die für die kooperative DNA-Bindung der p53 DBD verantwortlich sind. Basierend auf den NMR-Daten konnte ein schlüssiges Modell des dimeren p53 DBD-DNA-Komplexes erstellt werden. Dieses läßt die Schlußfolgerung zu, daß die identifizierte Dimerisierungs-Kontaktfläche in der H1 Helix auch die tatsächliche Kontaktfläche im tetrameren p53-DNA-Komplex darstellt. Die Bedeutung dieser Kontaktfläche wird ferner von der Beobachtung gestützt, daß zum einen die H1 Helix häufig von inaktivierenden Mutationen betroffen ist und daß zum anderen der mutmaßliche p53 Inhibitor 53BP2 über einen seiner ankyrin repeats diese Region blockiert. Auf der Grundlage von Symmetrie-Überlegungen wird schließlich diskutiert, daß tetrameres p53 potentiell räumlich getrennte und nicht aufeinander folgende Consensus-Bindungsstellen im Promoterbereich von p53-Zielgenen in einer "Sandwich"-artigen Weise verknüpfen und so DNA-Schleifen erzeugen könnte, wie sie durch Elektronenmikroskopie bei transkriptionell aktiven p53 Komplexen beobachtet wurden. Mit der Entdeckung der p53 Homologen p63 und p73 vor wenigen Jahren wurde eine p53 Familie von Proteinen mit unterschiedlichen Funktionen in der Tumorsuppression, Differenzierung und Entwicklung definiert. Der biochemische und biophysikalische Vergleich der p53 DBD mit der homologen p63 DBD ergab einige Besonderheiten. Im Gegensatz zur p53 DBD bindet die isolierte monomere p63 DBD nicht spezifisch an p53 Consensus-DNA-Bindungsstellen, wogegen beide DBDs als GST-Fusionssprotein, und daher als artifizielle Dimere vorliegend, mit vergleichbarer Affinität und Spezifität an p53 Consensus-DNA-Bindungsstellen binden. Außerdem wurde durch Kalorimetrie (Tm=61°C für p63 versus 44°C für p53) und Gleichgewichts-Entfaltung ([Urea]50%=5.2 M für p63 versus 3.1 M für p53) gezeigt, daß die Faltung der p63 DBD im Vergleich zur p53 DBD bemerkenswert stabil ist. Eine Analyse des Sequenz-Alignments der p53 und p63 DBDs und ein Homologie-Modell der p63 DBD heben vor allem Unterschiede um ein Segment nahe der H1 Helix hervor, welche die durch NMR-Spektroskopie identifizierte Dimerisierungs-Kontaktfläche in der p53 DBD ausbildet. Dieser Unterschied könnte die Ursache für die verminderte DNA-Bindungskooperativität der p63 DBD sein. Eine Reihe von Publikationen hat gezeigt, daß die Inhibition der p53-MDM2-Interaktion eine Möglichkeit zur pharmakologischen Intervention in der Tumortherapie darstellen könnte. In dieser Arbeit wurde humanisiertes XDM2 Protein aus Xenopus laevis, das über eine humanisierte p53-Bindungsstelle verfügt, im Komplex mit einem hochaffinen, künstlichen Peptidantagonisten kristallisiert. Die Kristallstruktur des hXDM2-Peptidkomplexes (Auflösung 2.0 Å) ermöglicht einen Einblick in den Bindungsmodus eines hochaffinen MDM2-Antagonisten und könnte zusammen mit der bekannten Struktur des MDM2-p53-Peptidkomplexes als Ausgangspunkt für das strukturbasierte, rationale Design von niedermolekularen Antagonisten der p53-MDM2-Interaktion dienen.     «

Das p53 Protein ist ein Transkriptionsfaktor, der als der wichtigste Tumorsuppressor in Säugern fungiert und in mehr als 50% aller humanen Tumoren mutiert ist. p53 reguliert die Expression einer Reihe von Genen, die eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Zellzyklus, der Anti-Angiogenese, der Apoptose und der Seneszenz spielen. Aufgrund seiner zentralen Rolle bei der Verhinderung der Tumorentstehung haben therapeutische Ansätze zur Reaktivierung der p53 Funktion in Tumorzellen großes Interesse...     »

The p53 protein is a transcription factor that acts as the major tumor suppressor in mammals and is mutated in more than 50% of all human tumors. p53 regulates the expression of a variety of genes controlling cell cycle, anti-angiogenesis, apoptosis and senescence. Due to the central role of p53 in tumor suppression, therapeutic approaches aiming to reactivate p53 function in tumor cells have found broad interest. In the scope of this PhD thesis an efficient system for the in vitro folding and purification of the p53 DNA binding domain (DBD) has been established. Subsequently, a comprehensive biochemical, biophysical and structural analysis of p53 DBD was performed in comparison to several p53 deletion mutants. In the course of this work it was shown, that fundamental prerequisites of the allosteric model of p53 regulation, that postulates a direct interaction between the C-terminal and the DNA binding domain of p53, do not apply. The data do rather suggest a regulatory interaction of the C-terminal domain with unspecific DNA. NMR spectroscopy allowed for the first time the experimental elucidation of the residues involved in cooperative DNA binding of p53 DBD. Based on the NMR data a conclusive model for the dimeric p53 DBD-DNA complex was created. This model allows the conclusion that the identified dimerization interface in the H1 helix also forms the actual interface in the tetrameric p53-DNA complex. The significance of this interface is further corroborated by the finding that hot spot mutations map to the H1 helix, and by the binding of the putative p53 inhibitor 53BP2 to this region via one of its ankyrin repeats. Based on symmetry considerations it is proposed that tetrameric p53 might link non-contiguous DNA consensus sites in a sandwich-like manner generating DNA loops as observed for transcriptionally active p53 complexes. The discovery of the p53 homologues p63 and p73 some years ago defined a family of p53 members with distinct roles in tumor suppression, differentiation and development. The biochemical and biophysical comparison of p53 DBD with homologous p63 DBD revealed novel features. In contrast to p53, the free monomeric p63 DBD does not show specific binding to p53 DNA consensus sites. However, GST-fused and thus dimerized p63 and p53 DBDs bind to p53 consensus sites with similar affinity and specificity. Furthermore, the p63 DBD is remarkably (thermo-) stable compared to p53 DBD as judged by differential scanning calorimetry (Tm=61°C for p63 versus 44°C for p53) and equilibrium unfolding ([urea]50%=5.2 M for p63 versus 3.1 M for p53). The sequence alignment of p53 and p63 DBDs and a homology model of p63 DBD highlight differences at a segment near the H1 helix that was identified as the said dimerization interface in p53 by NMR spectroscopy. This distinction might be causative for the reduced DNA binding cooperativity of p63 DBD. Several recent publications have shown that the inhibition of the p53-MDM2-interaction might represent an opportunity for pharmacological intervention in tumor therapy. In this PhD thesis humanized XDM2 protein from Xenopus laevis containing a human p53 binding site was crystallized in complex with an artificial, high-affinity peptide antagonist. The crystal structure of the hXDM2-peptide complex (resolution 2.0 Å) allows insight into the binding mode of a high-affinity antagonist. Together with the known structure of the HDM2-p53 peptide complex it could serve as a starting point for the rational design of low-molecular weight antagonists that inhibit the p53-MDM2-interaction.     «

The p53 protein is a transcription factor that acts as the major tumor suppressor in mammals and is mutated in more than 50% of all human tumors. p53 regulates the expression of a variety of genes controlling cell cycle, anti-angiogenesis, apoptosis and senescence. Due to the central role of p53 in tumor suppression, therapeutic approaches aiming to reactivate p53 function in tumor cells have found broad interest. In the scope of this PhD thesis an efficient system for the in vitro folding and p...     »