Im ersten Teilprojekt der vorliegenden Dissertation wurde das Calpastatin, der endogene Inhibitor der Calpaine, mittels NMR-Spektroskopie strukturell charakterisiert. Das Calpastatin umfasst eine aminoterminale Domäne mit unbekannter Funktion und vier inhibitorisch aktive Domänen. Sowohl das rekombinante Volllängenprotein als auch isolierte inhibitorische Domänen zeigten volle Aktivität. Die rekombianten Proteine wiesen ungewöhnliche physikochemische Eigenschaften auf. Eine strukturelle Charakterisierung der ersten inhibitorischen Domäne mittels NMR-Spektroskopie ergab, dass das Protein in Lösung unter physiologischen Bedingungen unstrukturiert vorliegt. Aufgrund der experimentellen Daten und einer Analyse der Primärstruktur konnte das Calpastatin in die Familie der unter physiologischen Bedingungen ungefalteten Proteine eingeordnet werden. Im zweiten Teilprojekt wurde ein ATP-abhängiger Peptidtransport in der Hefe S. cerevisiae untersucht. Die Transportaktivität konnte durch subzelluläre Fraktionierungen im Endoplasmatischen Retikulum der Hefe lokalisiert werden. Die Volumenabhängigkeit des Transports an mikrosomalen Vesikeln und der Einsatz semi-intakter Hefezellen sprechen dafür, dass es sich bei der beobachteten Aktivität um einen Import von Peptiden handelt. Weitere Experimente zeigten, dass die Transportrate von der Reaktionstemperatur und der Peptidkonzentration abhängig ist. Eine Beteiligung der Hefeproteine Mdl1p und Mdl2p am Transport konnte anhand von Deletionsmutanten ausgeschlossen werden. Ferner konnten beide Proteine anhand von subzellulären Fraktionierungen in mitochondrialen Membranen nachgewiesen werden.     «

Im ersten Teilprojekt der vorliegenden Dissertation wurde das Calpastatin, der endogene Inhibitor der Calpaine, mittels NMR-Spektroskopie strukturell charakterisiert. Das Calpastatin umfasst eine aminoterminale Domäne mit unbekannter Funktion und vier inhibitorisch aktive Domänen. Sowohl das rekombinante Volllängenprotein als auch isolierte inhibitorische Domänen zeigten volle Aktivität. Die rekombianten Proteine wiesen ungewöhnliche physikochemische Eigenschaften auf. Eine strukturelle Charakte...     »

The structural characterisation of calpastatin, the endogenous inhibitor of calpaine, by NMR spectroscopy was the first subproject of this thesis. Calpastatin comprises an aminoterminal domain of unknown function and four inhibitory active domains. Both the full length protein and the isolated inhibitory domains showed full activity. The recombinant proteins possessed exceptional physico-chemical properties. NMR studdies of the first inhibitory domain of calpastatin revealed an unstructured conformation in solution. Based on the experimental data and the analysis of the primary structure calpastatin was shown to be a member of the family of natively unfolded proteins. An ATP-dependent peptide translocation in the yeast S. cerevisiae was subject of the second subproject. The transport activity was localized to the endoplasmic reticulum of yeast by subcellular fractionation. The transport was shown to be dependent on the volume of microsomal vesicles and was also detected in semi-intact yeast cells. Both results argue for an peptide import into the lumen of the endoplasmic reticulum. Further experiments regarding the transport rate showed a dependency on the reaction temperature and peptide concentration. Mutant yeast strains indicated the yeast proteins Mdl1p and Mdl2p to be not involved in the transport process. Both proteins were localized to mitochondrial membranes by subcellular fractionation.     «

The structural characterisation of calpastatin, the endogenous inhibitor of calpaine, by NMR spectroscopy was the first subproject of this thesis. Calpastatin comprises an aminoterminal domain of unknown function and four inhibitory active domains. Both the full length protein and the isolated inhibitory domains showed full activity. The recombinant proteins possessed exceptional physico-chemical properties. NMR studdies of the first inhibitory domain of calpastatin revealed an unstructured conf...     »