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- Original title:
- Development of a Theoretical Workflow for Metabolic Engineering and its Application to Terpenoid Production in Escherichia coli
- Translated title:
- Entwicklung eines theoretischen Workflows für Metabolic Engineering und seine Anwendung auf die Terpenoidproduktion in Escherichia coli.
- Author:
- Valderrama Gomez, Miguel Angel
- Year:
- 2018
- Document type:
- Dissertation
- Faculty/School:
- Fakultät für Maschinenwesen
- Advisor:
- Kremling, Andreas (Prof. Dr.)
- Referee:
- Kremling, Andreas (Prof. Dr.); Kaleta, Christoph (Prof. Dr.)
- Language:
- en
- Subject group:
- CIT Chemie-Ingenieurwesen, Technische Chemie, Biotechnologie
- Keywords:
- Metabolic Engineering, stoichiometric modeling, kinetic modeling
- Translated keywords:
- Metabolic Engineering, stöchiometrische Modellierung, kinetische Modellierung
- TUM classification:
- CIT 900d; CIT 009d
- Abstract:
- Metabolic Engineering is an emerging science aiming at the development of cellular factories for the overproduction of valuable chemicals. Target molecules can be either naturally produced by endogenous metabolic pathways, or the host metabolism should be complemented by a non-inherent metabolic pathway to enable their heterologous production. Over the past decades, mathematical modeling of cellular metabolism for strain and process optimization has given rise to a more rational, model-based Metabolic Engineering science. However, theoretical workflows providing advice on limitations and proper application of the vast number of available mathematical tools are still scarce. Initially, we review the application of mathematical methods to increase the production of succinate in engineered strains. Succinate is an important building block whose biotechnological production has gained much attention in the last decade. From this initial work, we conclude that direct experimental implementation of model predictions (in silico knowledge) is not a straightforward process yet. One of the many reasons is the intrinsic complexity of living systems, which cannot be fully captured by the simplicity of widely used stoichiometric models of metabolism. Additionally, incongruences in the modeling process and the reporting of experimental results hamper a proper assessment of the prediction power of current modeling approaches. Motivated by these observations, we developed a theoretical workflow for metabolic engineering, highlighting capabilities and limitations of each method. The workflow considers the application of not only constraint-based methods like Flux Balance Analysis (FBA), which have been traditionally used to understand optimality principles shaping bacterial metabolism, but also of kinetic-based methods whose spread has been hindered so far by limitations related to model parametrization and to high demand on computational power required to analyze genome-scale kinetic models. While developing the workflow, we paid special attention to consider the so-called metabolic burden, a phenomenon presented in "loaded" cells and characterized by the reduction of both biomass yield and critical growth rate for acetate secretion. The suggested protocol was mainly applied to generate in silico knowledge, aimed to guide future experimental efforts towards optimization of taxadiene production in Escherichia coli (E. coli) at the strain and process level. Taxadiene is a precursor molecule for the anticancer drug taxol and its biotechnological production has gained much attention due to the low yields of the traditional extraction process from the bark of the pacific yew tree. During the development of a flexible taxadiene producing strain, simultaneous utilization of glucose and xylose by E. coli was also analyzed. By applying various tools described in the protocol, metabolic load and effects arising from simultaneous sugar uptake were assessed, especially focusing on the production potential of each strain. This analysis should allow the selection of strain candidates for further optimization.
- Translated abstract:
- Metabolic Engineering ist ein relativ neues Wissensgebiet im Bereich der Life Sciences, das anstrebt, effiziente zelluläre Fabriken zur Herstellung wichtiger chemischer Stoffe zu entwickeln. Ein vorgegebenes Zielmolekül kann entweder durch - bereits im zellulären Metabolismus - vorhandene biochemische Reaktionen produziert werden, oder der Stoffwechsel des Wirtmikroorganismus wird durch einen nichtinhärenten Stoffwechsel ergänzt, um die heterologe Produktion des Zielmoleküls zu ermöglichen. In den letzten Jahrzehnten hat die Anwendung mathematischer Ansätze zur Modellierung des zellulären Metabolismus zur Stamm- und Prozessoptimierung dazu geführt, dass das Metabolic Engineering sich von einer eher empirischen zu einer theoretischen und modellbasierten Wissenschaft gewandelt hat. Theoretische Workflows, die Hinweise auf die Einschränkungen und die korrekte Anwendung der vielen verfügbaren mathematischen Modellierungsansätze geben, sind jedoch immer noch selten. Zunächst wird gezeigt, wie mathematische Methoden zur Optimierung der Bernsteinsäurenproduktion in gentechnisch veränderten Stämmen angewandt wurden. Bernsteinsäure ist ein wichtiger Baustein, dessen biotechnologische Produktion in den letzten Jahren viel Beachtung gefunden hat. Aus dieser ersten Untersuchung leiten wir her, dass die direkte experimentelle Umsetzung von modellbasierten Vorhersagen hinsichtlich genetischer Modifikationen nicht immer erfolgreich ist. Einer von vielen Gründen hierfür ist die intrinsische Komplexität lebendiger Organismen, die durch verbreitete stöchiometrische Modelle nicht vollständig abgebildet werden kann. Darüber hinaus erschweren Inkongruenzen im Modellierungsprozess und die Umsetzung von Modellprädiktionen eine angemessene Bewertung der Vorhersagekraft aktueller Modellierungsansätze. Dadurch angeregt, entwickeln wir einen theoretischen Workflow für das Metabolic Engineering, in dem die Möglichkeiten und Grenzen verschiedener Methoden herausgearbeitet werden. Der Workflow beschreibt die Anwendung nicht nur von stöchiometrischen Methoden wie Flux Balance Analysis (FBA), sondern auch von kinetischen Methoden, deren Verbreitung bislang durch Einschränkungen in Bezug auf die Modellparametrisierung und hohe Anforderungen an die Rechenleistung behindert worden ist. Bei der Entwicklung des Workflows wird besonderes Augenmerk auf die sogenannte metabolische Belastung gelegt, ein Phänomen, das in "beladenen" Zellen auftritt und durch die Verringerung sowohl der Biomasseausbeute als auch der kritischen Wachstumsrate für die Sekretion von Essigsäure gekennzeichnet ist. Der vorgeschlagene Workflow wird hauptsächlich hergenommen, um in silico Erkenntnisse zu generieren, die darauf abzielen, zukünftige experimentelle Arbeiten zur Optimierung der Taxadien-Produktion in Escherichia coli (E. coli) auf der Stamm- und Prozessebene zu leiten. Taxadien ist ein Vorläufermolekül für das Krebsmedikament Taxol; seine biotechnologische Produktion hat aufgrund der geringen Erträge des traditionellen Extraktionsprozesses aus der Rinde der pazifischen Eibe viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Zugleich mit der Entwicklung eines Taxadien-Produktionsstammes wird auch die gleichzeitige Verwertung von Glukose und Xylose durch E. coli untersucht. Unter Anwendung verschiedener Werkzeuge werden die metabolische Belastung und die Auswirkungen, die von der gleichzeitigen Zuckeraufnahme herrühren, bewertet, wobei insbesondere das Produktionspotential jedes Stammes im Mittelpunkt steht. Diese Analyse soll die Auswahl von Produktionsstammkandidaten zur weiteren Optimierung ermöglichen.
- WWW:
- https://mediatum.ub.tum.de/?id=1435464
- Date of submission:
- 10.04.2018
- Oral examination:
- 07.08.2018
- File size:
- 5848086 bytes
- Pages:
- 199
- Urn (citeable URL):
- https://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:91-diss-20180807-1435464-1-6
- Last change:
- 19.09.2018
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