Coenzyme A is a fundamental cofactor for many synthetic and degradative reactions in intermediary and energy metabolism. It is synthesized in five steps from pantothenate (PA) also known as vitamin B5. Plants, fungi, and bacteria synthesize PA from beta-alanine and pantoate in a reaction catalyzed by the enzyme panothenate synthetase (PS), while humans have to assume it with the diet. Recently, coenzyme A (CoA) biosynthetic genes in bacteria, plants and humans have all been identified and cloned. Phosphorylation of PA, catalyzed by the enzyme pantothenate kinase (PanK), is thought to be the key regulatory step in CoA biosynthesis. Despite our knowledge on CoA synthesis, some aspects of its metabolism are as yet ill understood. The aim of this work was to investigate the regulation of PA in plants and the synthesis of PA in archaea. In an attempt to find a correlation between PA and CoA, both metabolites were quantified in developing seeds of Arabidopsis thaliana between 4 and 21 days after flowering (DAF). The most important observation was that PA levels exceeded CoA levels throughout seed development. The PA content varied between 25 and 250 nmol/g dry weight (DW) while the sum of CoA and acetyl-CoA was always below 25 nmol/g DW. Thus, PA is not rate-limiting for CoA biosynthesis. Accumulation of PA is in agreement with its phosphorylation as the rate-limiting step in the CoA pathway, i.e. with PanK as the major regulator of intracellular CoA levels. The ratio between PA and CoA levels varies more than 10-fold during seed development, indicating that the synthesis of PA is not directly controlled by CoA levels. PA levels were very high at the beginning of seed development with the maximum observed at 5 DAF. Thereafter, PA levels decreased and reached a minimum at 16 DAF. In contrast, the combined CoA and acetyl-CoA levels were very low for young seeds and then reached the maximum at 12 DAF. Towards maturation, CoA levels were very low or undetectable. This is consistent with PA as precursor of CoA and can be plausibly explained by assuming that a substantial amount of newly synthesized CoA is used in fatty acid biosynthesis for the production of acyl carrier protein and long chain acyl-CoA species. In the second part of this work, the archaeal biosynthesis of PA and CoA was investigated. Conserved CoA biosynthetic genes were previously analyzed in ompletely sequenced genomes. This showed that many archaeal genomes contain no homologues to bacterial or eukaryotic genes for the synthesis of 4’-phospho-PA. Using phylogenetic profiling and chromosomal proximity, candidate genes for archaeal PS and PanK enzymes were identified in this group. Putative archaeal PS and PanK genes are contained in the Clusters of Orthologous Genes (COG) 1701 and 1829, respectively. The cloned COG1701 genes from M. mazei and M. jannaschii were demonstrated to functionally complement an auxotrophic E. coli strain deficient in the synthesis of PA. The COG1701 gene from M. mazei was then overexpressed in E. coli, and the encoded putative M. mazei PS (MmPS) was purified as a His-tag protein. This enzyme was able to synthesize PA from beta-alanine, pantoate and ATP. The identity of PA was confirmed by thin-layer chromatography (TLC) and by transformation into 4’-phospho-PA using purified PanK from E. coli. HPLC analysis of adenosine nucleotides showed that ATP was hydrolyzed and ADP was formed in the course of the MmPS reaction. Thus, the MmPS-catalyzed reaction differs from the one catalyzed by E. coli PS, which is an AMP-forming synthetase. MmPS is conserved in all archaea (COG1701) but completely unrelated to bacterial PS. This is the first report of an archaeal PS and confirms an earlier hypothesis that proposed, based on comparative genomics, independent evolution of PA biosynthesis in archaea and bacteria.     «

Coenzyme A is a fundamental cofactor for many synthetic and degradative reactions in intermediary and energy metabolism. It is synthesized in five steps from pantothenate (PA) also known as vitamin B5. Plants, fungi, and bacteria synthesize PA from beta-alanine and pantoate in a reaction catalyzed by the enzyme panothenate synthetase (PS), while humans have to assume it with the diet. Recently, coenzyme A (CoA) biosynthetic genes in bacteria, plants and humans have all been identified and cloned...     »

CoenzymA ist ein grundlegender Vorläufer für verschiedene synthetische und abbauende Reaktionen im Intermediär- und Energiemetabolismus. Es wird in fünf Schritten aus Pantothenat (PA), das auch als Vitamin B5 bekannt ist, synthetisiert. Pflanzen, Pilze und Bakterien synthetisieren PA aus beta-Alanin und Pantoat in einer Reaktion, die vom Enzym Pantothenat-Synthetase (PS) katalysiert wird, während Menschen PA mit der Nahrung aufnehmen müssen. Kürzlich wurden alle biosynthetischen Gene für die CoenzymA (CoA)-Synthese aus Pflanzen, Pilzen und Menschen identifiziert und kloniert. Man nimmt an, dass die Phosphorylierung von PA durch das Enzym Pantothenat-Kinase (PanK) der entscheidende regulierende Schritt in der CoA-Biosynthese ist. Trotz der Kenntnisse über die CoA-Synthese sind verschiedene Aspekte ihres Metabolismus noch unklar. Das Ziel dieser Arbeit war es die Regulation von PA in Pflanzen und die Synthese von PA in Archäen zu erforschen. Mit dem Ziel eine Korrelation zwischen PA und CoA zu finden wurden beide Metabolite in sich entwickelnden Arabidopsis thaliana-Samen zwischen 4 und 21 Tagen nach dem Blühen (Days after flowering, DAF) quantifiziert. Die wichtigste Beobachtung war, dass die PA-Mengen während der gesamten Samenentwicklung die CoA-Mengen übertrafen. PA-Konzentrationen variierten zwischen 25 und 250 nmol /g Trockenmasse (dry weight, DW) während die Gesamtmenge aus CoA und AcetylCoA immer weniger als 25 nmol/g DW betrug. Daher ist PA nicht der limitierende Faktor der CoA-Biosynthese. Die Akkumulierung von PA stimmt damit überein, dass dessen Phosphorylierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im CoA-Metabolismus darstellt, mit PanK als wichtigstem Regulator des intrazellulären CoA-Gehalts. Das Verhältnis zwischen PA und CoA veränderte sich im Laufe der Samenentwicklung um mehr als das zehnfache. Das zeigt, dass die Synthese von PA nicht direkt vom CoA-Gehalt kontrolliert wird. Zu Beginn der Samenentwicklung war der PA-Gehalt sehr hoch mit einem Maximum am 5. DAF. Danach verringerte sich der PA-Gehalt und erreichte bei 16 DAF sein Minimum. Im Gegensatz dazu war der Gesamtgehalt an CoA und Acetyl-CoA in jungen Samen sehr niedrig und erhöhte sich bis zu einem Maximum am 12. DAF. In der weiteren Entwicklung war der CoA-Gehalt stets niedrig oder nicht detektierbar. Dies steht im Einklang mit PA als Vorstufe von CoA und kann durch die Annahme, dass ein erheblicher Anteil des neu synthetisierten CoA für die Herstellung von Acylcarrier-Protein und langkettigen Acyl-CoA-Derivaten in der Fettsäurebiosynthese verwendet wird, erklärt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die PA- und CoA-Biosynthese in Archäen erforscht. Die konservierten CoA biosynthetischen Gene wurden zuerst in bereits komplett sequenzierten Genomen analysiert. Dies zeigte, dass viele Archäen-Genome keine Homologen zu bakteriellen oder eukaryotischen Genen für die Synthese von 4’-Phosphopantethein enthalten. Via phylogenetischer Analyse und „Chromosomal Proximity“ wurden Kandidaten für PS-und PanK-Enzyme identifiziert. Putative PS und PanK lagen im Cluster orthologer Gene (COG) 1701 bzw. 1829. Für die klonierten Gene des COG 1701 aus M. mazei und M. jannaschii konnte gezeigt werden, dass sie in der Lage sind einen auxotrophen E. coli-Stamm mit fehlender PA-Synthese zu komplementieren. Die COG 1701 Gene aus M. mazei wurden in E.coli überexprimiert und die putative M. mazei-PS (MmPS) als His-tag-Protein aufgereinigt. Dieses Enzym war in der Lage PA aus beta-Alanin, Pantoat und ATP zu synthetisieren. PA wurde mittels Dünnschichtchromatographie und Umwandlung in 4’-Phospho-PA durch PanK aus E. coli identifiziert. Die HPLC Analyse von Adenosinnucleotiden zeigte, dass durch die MmPS-Reaktion ATP hydrolysiert und ADP gebildet wurde. Die MmPS katalysierte Reaktion unterscheidet sich also von der Reaktion der E. coli PS, welche eine AMP-bildende Synthetase ist. MmPS ist in allen Archäen konserviert, unterscheidet sich aber grundlegend von der bakteriellen PS. In dieser Arbeit wird zum erstenmal eine PS aus Archäen beschrieben und eine frühere Hypothese bestätigt, die basierend auf vergleichender Genomik von einer unabhängigen Evolution der PA-Biosynthese in Archäen und Bakterien ausgeht.     «

CoenzymA ist ein grundlegender Vorläufer für verschiedene synthetische und abbauende Reaktionen im Intermediär- und Energiemetabolismus. Es wird in fünf Schritten aus Pantothenat (PA), das auch als Vitamin B5 bekannt ist, synthetisiert. Pflanzen, Pilze und Bakterien synthetisieren PA aus beta-Alanin und Pantoat in einer Reaktion, die vom Enzym Pantothenat-Synthetase (PS) katalysiert wird, während Menschen PA mit der Nahrung aufnehmen müssen. Kürzlich wurden alle biosynthetischen Gene für die Coe...     »