Soluble epoxide hydrolase (sEH) represents a promising new drug target in the treatment of hypertension and vascular inflammation. Its chemical inhibition was previously shown to lower blood pressure, protect the kidney from hypertension-caused damage as well as trigger anti-inflammatory effects. This dissertation is based on two projects connected to the elimination of sEH activity: the development of novel fluorescent assay systems testing potential sEH inhibitors and the post-transcriptional down-regulation of this enzyme on the cellular level by RNA interference (RNAi). In the first part, a series of novel α-cyanoester and α-cyanocarbonate epoxides were evaluated as potential sEH substrates for the development of two test systems: a rapid kinetic assay with improved sensitivity compared to the existing spectrophotometric test system as well as an endpoint assay with long incubation times that could be used for high-throughput screening of large compound libraries. Cyano(6-methoxy-naphthalen-2-yl)methyl trans-((3-phenyloxiran-2-yl)methyl) carbonate displayed a comparatively high specific activity with human sEH and was therefore selected for the rapid test system, while (3-phenyl-oxiranyl)-acetic acid cyano-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-methyl ester was chosen for the endpoint assay due to its high aqueous solubility and stability. Enzyme and substrate concentrations were optimized for both systems to achieve the desired assay sensitivity, reliability and reproducibility. The subsequent assay validation, which employed these optimized concentrations to test previously characterized inhibitors, confirmed the usefulness and applicability of both systems regarding sensitivity, accuracy and precision. The two novel fluorescence-based assay systems will be valuable tools in the development of improved sEH inhibitors and will thus help to enhance the treatment of vascular inflammation and hypertension. The second part deals with the endogenous silencing mechanism RNAi to post-transcriptionally down-regulate sEH and thus to provide an alternative to its chemical inhibition, which is still lacking a compound of therapeutic value. This objective first required the search for an appropriate human cell model system expressing sEH in easily detectable amounts. Out of the examined cell lines, the prostate carcinoma cell line 22RV1 was selected due to its comparatively high specific sEH activity. Subsequent experiments introducing synthetic siRNAs (short interfering RNAs) into the cells by electroporation were able to repeatedly show a 50% down-regulation of the target gene expression up to at least 96 h. This result is based on analyses of enzyme activity levels as well as mRNA levels of siRNA-treated cells. Although a higher impact on sEH mRNA and enzyme activity level was expected by RNAi, this study might represent a first step toward an alternative therapeutic approach for the cure of glaucoma, COPD (chronic obstructive pulmonary disease) and maybe even hypertension.     «

Soluble epoxide hydrolase (sEH) represents a promising new drug target in the treatment of hypertension and vascular inflammation. Its chemical inhibition was previously shown to lower blood pressure, protect the kidney from hypertension-caused damage as well as trigger anti-inflammatory effects. This dissertation is based on two projects connected to the elimination of sEH activity: the development of novel fluorescent assay systems testing potential sEH inhibitors and the post-transcriptional...     »

Die chemische Hemmung des Enzyms Lösliche Epoxidhydrolase (sEH) bietet einen neuen Ansatz zur Therapie von Bluthochdruck und vaskulären Entzündungskrankheiten. In Experimenten konnte bereits belegt werden, dass durch diese Behandlung sowohl die Senkung von Bluthochdruck, der Schutz von Nieren vor bluthochdruckbedingter Schädigung als auch ein weiterer antiinflammatorischer Effekt möglich ist. Die hier vorliegende Dissertation basiert auf zwei unterschiedlichen Projekten, die beide mit der Ausschaltung der sEH-Aktivität in Zusammenhang stehen: der Entwicklung neuer, fluoreszenzbasierter Testsysteme, die chemische Verbindungen auf ihr sEH-Inhibitionspotential überprüfen, und der posttranskriptionellen Ausschaltung dieses Enzyms auf zellulärer Ebene durch RNA Interferenz (RNAi). Im ersten Teil wurde eine Reihe neuartiger α-Cyanoester- und α-Cyanokarbonatepoxide als sEH-Substrate im Zusammenhang mit der Entwicklung sowohl eines schnell durchführbaren kinetischen Tests als auch eines Endpunktassays charakterisiert und erprobt. Die hohe spezifische Aktivität von Cyano(6-methoxy-naphthalen-2-yl)methyl-trans-((3-phenyloxiran-2-yl)methyl)-carbonat in Kombination mit humaner löslicher Epoxidhydrolase gab den Ausschlag für die Wahl dieses Substrates für den kinetischen Test. Dieser sollte im Vergleich zum bestehenden spektrophotometrischen System eine deutlich erhöhte Sensitivität aufweisen, um so bisher in ihrer Inhibitionskraft schwer unterscheidbare sEH-Inhibitoren differenzieren zu können. (3-Phenyl-oxiranyl)-essigsäure-cyano-(6-methoxy-naphthalen-2-yl)-methylester wurde dagegen aufgrund seiner hohen Löslichkeit und Stabilität in wässriger Umgebung als Substrat für einen Endpunkttest mit langer Reaktionszeit gewählt. Die Entwicklung eines solchen Assays sollte es ermöglichen, große Bibliotheken chemischer Verbindungen in einem Verfahren mit hohen Durchsatzraten auf sEH-inhibierende Stoffe zu sichten. Enzym- und Substratkonzentrationen wurden für beide Systeme optimiert, um die angestrebten Testempfindlichkeiten und -reproduzierbarkeiten zu gewährleisten. Die darauf folgende Validierung der entwickelten Assays mit bereits charakterisierten sEH-Inhibitoren bestätigte und bekräftigte deren Nutzen und praktische Durchführbarkeit. Die beiden beschriebenen Testsysteme werden sich bei der Weiterentwicklung bestehender und Entdeckung neuer sEH-Inhibitoren mit Sicherheit als äußerst wertvoll erweisen und damit höchstwahrscheinlich die Behandlung von Bluthochdruck und vaskulären Entzündungen verbessern. Im zweiten Teil wurde die Möglichkeit untersucht, sEH durch den endogenen Mechanismus RNAi, der posttranskriptionell und spezifisch der Expression von Zielgenen entgegenwirkt, herunterzuregulieren und somit eine Alternative zur chemischen Hemmung des Enzyms zu schaffen. Voraussetzung für dieses Projekt war allerdings, ein zelluläres Modellsystem zu finden, das sEH in detektierbaren Mengen exprimiert. Nach der Untersuchung mehrerer humaner Zelllinien wurde die Prostatakrebszelllinie 22RV1 aufgrund ihrer vergleichsweise hohen spezifischen sEH-Aktivität ausgewählt, als Modell für die weiteren Experimente dieser Studie zu fungieren. Hierbei konnte – ausgelöst durch Elektroporation mit synthetischen siRNAs (short interfering RNAs) – reproduzierbar eine 50%ige sEH-Reduktion ausgelöst werden, die sowohl auf Enzymaktivitätsebene als auch auf mRNA-Ebene feststellbar war und bis mindestens 96 h nach der Elektroporation anhielt. Obgleich die Wirkung der siRNA-Behandlung auf die zelluläre sEH-Expression geringer war als erwartet, kann diese Studie doch einen ersten Schritt in Richtung eines alternativen therapeutischen Ansatzes zur Behandlung von grünem Star, chronischem unspezifischem respiratorischem Syndrom (COPD) und vielleicht sogar Bluthochdruck darstellen.     «

Die chemische Hemmung des Enzyms Lösliche Epoxidhydrolase (sEH) bietet einen neuen Ansatz zur Therapie von Bluthochdruck und vaskulären Entzündungskrankheiten. In Experimenten konnte bereits belegt werden, dass durch diese Behandlung sowohl die Senkung von Bluthochdruck, der Schutz von Nieren vor bluthochdruckbedingter Schädigung als auch ein weiterer antiinflammatorischer Effekt möglich ist. Die hier vorliegende Dissertation basiert auf zwei unterschiedlichen Projekten, die beide mit der Aussc...     »