Toll-like Rezeptoren (TLR) sind signalgebende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die nach Kontakt mit Pathogenen eine Immunantwort auslösen und steuern. Diese Rezeptoren erkennen unterschiedliche Komponenten, wie z. B. bakterielles Lipopolysaccharid, Peptidoglykan, Flagellin oder doppelsträngige RNA. In dieser Arbeit wurden die Toll-like Rezeptoren 7 und 8 (TLR7 und TLR8) aus dem Menschen und der Maus identifiziert, kloniert und untersucht. Das Hauptaugenmerk lag auf der Identifizierung der Liganden von TLR7 und TLR8. Als erster Ligand für humanen TLR8 konnte mithilfe eines transienten Transfektionssytems eine Mischung aus den Nukleosiden Guanosin und Uridin identifiziert werden. Diese Beobachtung ließ sich bei murinem TLR8 jedoch nicht bestätigen. Die antivirale Substanz R-848 (Resiquimod) aus der Familie der Imidazoquinoline konnte als erster synthetischer Stimulus für humanen und murinen TLR7 sowie humanen TLR8 beschrieben werden. Über murinen TLR8 konnte wiederum keine Aktivierung von Immunzellen oder Sekretion von Zytokinen durch R-848 festgestellt werden. Im weiteren Verlauf konnte ein weiterer synthetischer Stimulus, der spezifisch für humanen und murinen TLR7 ist, identifiziert werden. Diese Substanz trägt den Namen Loxoribin (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin), ist ein Analogon der Purinbase Guanosin und besitzt ebenfalls antivirale und antitumor Aktivität. Die Loxoribin-vermittelte Aktivierung von Immunzellen über TLR7 konnte durch die Verwendung von TLR7-und MyD88-defizienten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte einzelsträngige GU-reiche RNA als physiologischer Ligand für humanen TLR8 und murinen TLR7 identifiziert werden. Die hier verwendete einzelsträngige RNA wurde in Form von Oligonukleotiden synthetisiert. Die Sequenz stammte aus der GU-reichen U5-Region des Humanen Immundefizienz Virus-1 (HIV-1; RNA40). Zusätzlich wurden noch zwei Varianten dieses RNA-Oligonukleotids synthetisiert, in denen jeweils alle Uridine (RNA41) und alle Guanosine (RNA42) gegen Adenosin ausgetauscht wurden. Im transienten Transfektionssystem konnte sowohl durch RNA40 als auch durch RNA42 eine Induktion von NF-κB durch humanen TLR8 ausgelöst werden. Durch Untersuchungen mit Zellen von TLR7-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass die, in den Zellen der Wildtyp-Maus beobachtete Sekretion inflammatorischer Zytokine durch RNA40 (RNA41 und RNA42 zeigten keinen Effekt) in der TLR7-/--Maus komplett aufgehoben war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass endosomale Reifung für die Aktivierung von TLR7 und TLR8 notwendig ist. Im Gegensatz zu TLR2 und 4, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, ist von TLR9 bekannt, dass er von endosomaler Reifung abhängig ist und in intrazellulären Vesikeln lokalisiert ist. Aufgrund der Sequenzhomologie zu TLR9 wurden TLR7 und TLR8 ebenfalls daraufhin untersucht, ob sie diese Eigenschaft besitzen. Die TLR7 und TLR8-vermittelte Signalweiterleitung konnte konzentrationsabhängig durch die Inhibitoren der endosomalen Reifung, Bafilomycin A1 und Rab5 GTPase-Mutante vermindert werden. In Anlehnung an TLR9 ist dies ein Hinweis darauf, dass auch TLR7 und TLR8 in intrazellulären Kompartimenten exprimiert werden. Gegen den humanen TLR8 wurde ein monoklonaler Antikörper generiert. Dazu wurde auf DNA-Ebene ein Expressionsvektor konstruiert, der die Expression eines hTLR8-Fusionsproteins für die Immunisierung der Maus ermöglicht. Nach Herstellung von genügend Protein wurde die gereinigte extrazelluläre hTLR8-Domäne der Maus injiziert. Es wurden monoklonale Antikörper nach der Methode von Köhler und Milstein generiert. Vier Hybridomklone konnten bestimmt werden, die einen monoklonalen Antikörper gegen humanen TLR8 sezernieren.     «

Toll-like Rezeptoren (TLR) sind signalgebende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die nach Kontakt mit Pathogenen eine Immunantwort auslösen und steuern. Diese Rezeptoren erkennen unterschiedliche Komponenten, wie z. B. bakterielles Lipopolysaccharid, Peptidoglykan, Flagellin oder doppelsträngige RNA. In dieser Arbeit wurden die Toll-like Rezeptoren 7 und 8 (TLR7 und TLR8) aus dem Menschen und der Maus identifiziert, kloniert und untersucht. Das Hauptaugenmerk lag auf der Identifizierung de...     »

Toll-like receptors (TLR) are signaling receptors of innate immunity, which elicit and trigger an immune response after contact to a cognate pathogen. These receptors recognize different components, e.g. bacterial lipoploysaccharide, peptidoglycan, flagellin and double-stranded RNA, respectively. In this work, human and murine Toll-like receptors 7 and 8 were identified, cloned and examined. The main focus of this thesis was the identification of ligands for TLR7 and TLR8. First, by using a transient transfection system based on HEK293-cells, a mixture of the nucleosides guanosin and uridine could be identified as a ligand for human, but not murine TLR8. The antiviral compound R-848 (resiquimod) which belongs to the family of imidazoquinolines was first identified as synthetic stimulus for human TLR8 and murine TLR7. In further studies another synthetic compound could be identified activating exclusively human and murine TLR7. This compound named loxoribine (7-ally-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine) is an analog of the purinbase guanosine and features antiviral and antitumor activity. The loxoribine-mediated activation of immune cells via TLR7 could also be shown by the utilization of TLR7- and MyD88-deficient mice. Finally, single-stranded GU-rich RNA oligonucleotides could be defined as the first physiological ligand for human TLR8 and murine TLR7. The sequence was derived from the GU-rich U5-region of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1, RNA40). Two further variants of this RNA-oligonucleotide were synthesized in which all uridines or all guanosines, were replaced by adenosines, respectively. In our transient transfection system, a induction of NF-κB through human TLR8 could be elicited either by RNA40 or RNA42. Further, TLR7-deficient murine cells showed a complete abolishment of the wildtype-cells specific secretion of inflammatory cytokines after stimulation with RNA40 (In this context, neither RNA41 nor RNA42 showed any effect). In addition, it could be shown that activation of TLR7 and TLR8 is depending on endosomal maturation. In contrast to TLR2 and 4, which are expressed on the cell surface, TLR9 is known to be localized in intracellular vesicles and to be contingent on endosomal maturation. Due to the sequence homology among TLR9, TLR7 and TLR8 we examined if TLR7 and TLR8 also showed these characteristics. TLR7 and TLR8 mediated signaling could be decreased concentration-dependent by the inhibitors of endosomal maturation, bafilomycin A1 and Rab5 GTPase-mutant. Therefore TLR7, 8 and 9 form a subfamily within the TLRs that is expressed in intracellular compartments and recognizes intracellular nucleic acids. In further addition, a monoclonal antibody was generated against human TLR8. First, an expression vector was constructed enabling the expression and subsequent purification of a human TLR8-fusion-protein. After producing sufficient amounts of protein, mice were injected for immunization. Antibody secreting hybridomas were generated using the protocol established by Kohler and Milstein and four clones secreting a monoclonal antibody against human TLR8 were established.     «

Toll-like receptors (TLR) are signaling receptors of innate immunity, which elicit and trigger an immune response after contact to a cognate pathogen. These receptors recognize different components, e.g. bacterial lipoploysaccharide, peptidoglycan, flagellin and double-stranded RNA, respectively. In this work, human and murine Toll-like receptors 7 and 8 were identified, cloned and examined. The main focus of this thesis was the identification of ligands for TLR7 and TLR8. First, by using a tran...     »