Scherer, Siegfried (Prof. Dr.); Bauer, Johann (Prof. Dr. Dr. h.c.)
Format:
Text
Sprache:
en
Fachgebiet:
BIO Biowissenschaften; LEB Lebensmitteltechnologie
Stichworte:
bacteriophage; Clostridium perfringens; holin; endolysin; lysogeny; sporulation; att site; cos site; genome
Übersetzte Stichworte:
Bakteriophage; Clostridium perfringens; Holin; Endolysin; Lysogenie; Sporulation; Genom
TU-Systematik:
BIO 306d; BIO 180d; LEB 020d
Kurzfassung:
Two temperate viruses f3626 and f8533 have been isolated from lysogenic Clostridium perfringens strains. Phage f3626 was chosen for a detailed analysis, and was inspected by electron microscopy, protein profiling, and host range determination. For the first time, the nucleotide sequence of a bacteriophage infecting a Clostridium species was determined. The virus belongs to the Siphoviridae family of the tailed phages, in the order Caudovirales. Its genome consists of a linear dsDNA molecules of 33507 nucleotides, with invariable 3'-protruding cohesive ends of 9 residues. Fifty open reading frames were identified, which are organized in 3 major life cycle-specific gene clusters. The genes required for lytic development show an opposite orientation and arrangement as compared to the lysogeny control region. A function could be assigned to 19 gene products, based upon bioinformatic analyses, N-terminal amino acid sequencing, or direct experimental evidence. These include DNA packaging proteins, structural components, the dual lysis system, a putative lysogeny switch, and proteins that are involved in replication, recombination, and modification of phage DNA. The presence of a putative sigma factor related to sporulation-dependent sigma factors and a putative sporulation-dependent transcriptional regulator suggest a possible interaction of f3626 with sporulation events in C. perfringens. It has been found that the f3626 attachment site attPP' has been found to be located in a non-coding region immediately downstream of int. Integration occurs into the bacterial attachment site attBB', located within the 3'-end of a guaA homologue. This essential housekeeping gene is functionally independent of the integration status, due to the reconstitution of its terminal codon by the phage sequence. C. perfringens commonly occurs in food and feed, can produce an enterotoxin frequently implicated in foodborne disease, and has a substantial negative impact on the poultry industry. As a step towards new approaches for its control, the lysis system of C. perfringens bacteriophage f3626 has been investigated, whose dual lysis gene cassette consists of a holin and an endolysin. Hol3626 features two membrane spanning domains (MSD) and represents a class II holin. A positively charged beta-turn between the two MSDs suggests that both the amino- and the carboxy-terminus of Hol3626 might be located outside of the cell membrane, a very unusual holin topology. Holin function was experimentally demonstrated by its ability to complement deletion of the heterologous phage l holin in lDSthf. The endolysin gene ply3626 was cloned in Escherichia coli. However, protein synthesis only occurred when the bacteria were supplemented with rare tRNAArg and tRNAIle genes. Formation of inclusion bodies could be avoided by drastically lowering the expression level. Amino-terminal modification by a hexa-histidine tag did not affect enzyme activity, and enabled purification by metal-chelate affinity chromatography. Ply3626 features a N-terminal amidase domain and an unique C-terminal portion, which might be responsible for the specific lytic range of the enzyme. All forty-eight tested strains of C. perfringens were sensitive to the murein hydrolase, whereas other clostridia and bacteria of other genera were generally not affected. The highly specific activity towards C. perfringens might be useful for novel biocontrol measures in food, feed, and complex microbial communities.
Übersetzte Kurzfassung:
Aus lysogenen C. perfringens Stämmen konnten zwei temperente Phagen, f3626 and f8533, isoliert werden. Eine detaillierte Analyse einschließlich Elektronenmikroskopie, Bestimmung der elektrophoretischen Mobilität der strukturellen Proteine, sowie eine Bestimmung des Wirts-Spektrum wurde mit dem Phagen f3626 durchgeführt. Erstmalig wurde die vollständige Nukleotid Sequenz eines Bakteriophagen bestimmt, welcher Organismen der Gattung Clostridium infizieren kann. Der Phage gehört in die Familie der Siphoviridae, innerhalb der Ordnung der Caudovirales (geschwänzte Phagen). Das Genom ist ein lineares dsDNS Molekül mit einer Größe von 33507 bp, welches einzelsträngige, 3'-überstehende, kohäsive Enden von 9 Nukleotiden besitzt. Fünfzig offene Leseraster (ORFs) konnten im phi3626 Genom identifiziert werden, deren Anordnung dieses in drei wesentliche Lebenszyklus-spezifische Genbereiche aufteilt. Der Genbereich verantwortlich für die Aufrechterhaltung des lysogenen Lebenszyklus ist im Vergleich zu den übrigen Genbereichen ("frühe" und "späte" Gene des lytischen Zyklus) gegenläufig organisiert. Aufgrund bioinformatischer Analysen, N-terminaler Aminosäure Sequenzierung und funktioneller Charakterisierungen konnten über 19 ORFs funktionelle Aussagen gemacht werden. So konnten folgende Proteine identifiziert werden: Proteine verantwortlich für die DNA Verpackung, strukturelle Proteine, die Proteine des Dualen-Lyse Systems, ein potentieller Lysogenie-Schalter und Proteine, die in der Replikation, Rekombination und Modifikation der Phagen DNA involviert sind. Die Gegenwart eines möglichen Sigma-Faktors, der Ähnlichkeiten aufweist zu Sporulations-abhängigen Sigma-Faktoren, und die eines weiteren Sporulations-abhängigen Transkriptionsfaktors weisen darauf hin, dass f3626 möglicherweise einen Einfluss auf Sporulations-spezifische Prozesse in C. perfringens hat. Die Integrationsstelle attPP ist in einem nicht-kodierenden Bereich vom f3626 Genom lokalisiert, direkt in Leserichtung und unterhalb von int. Eine Integration findet an der bakteriellen attBB Stelle statt, welche im 3' Ende eines guaA-ähnlichen Gens zu finden ist. Dieses essentielle Haushaltungs-Gen ist in seiner Funktion unabhängig vom Lysogeniestatus, da durch eine Integration das ursprüngliche Stopp-Codon an gleicher Stelle vom Phagen bereitgestellt wird. C. perfringens kann häufig aus Futter- und Lebensmitteln isoliert werden und einige Stämme sind in der Lage ein Enterotoxin produzieren, welches ursächlich ist für die vom Mikroorganismus hervorgerufenen Fälle von Lebensmittelvergiftungen. Das Bakterium wird aber auch mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, welche zu beachtlichen wirtschaftlichen Einbussen in der Geflügel-Industrie führen. Daher wurde für die Kontrolle dieses Bakteriums das lytische System des temperenten Bakteriophagen f3626 untersucht. Das zunächst durch Bioinformatik identifizierte Lyse Module codiert ein Holin und ein Endolysin. Hol3626 besitzt zwei transmembrane Bereiche (MSD) und wird folglich den Klasse II Holinen zugeordnet. Jedoch weist der positiv geladene Bereich zwischen den beiden MSD darauf hin, das sowohl das Amino- als auch das Carboxy-Ende des Hol3626 möglicherweise außerhalb der Zellmembran lokalisiert sind, was eine sehr außergewöhnlichen Topologie darstellen würde. Die Funktion des Holins konnte experimentell gezeigt werden durch seine Fähigkeit, das Fehlen des heterologen l Holins in Testsystem lDSthf zu komplementieren. Das Gen ply3626, welches das Endolysin kodiert, wurde zunächst in einen gängigen Stamm von Escherichia coli kloniert und exprimiert. Jedoch war eine Protein-Synthese nur möglich, nachdem das Bakterium mit den im Organismus selten vorkommenden tRNAArg und tRNAIle Genen sublementiert wurde. Die hierbei nach Induktion zunächst beobachtete Bildung von Einschlusskörpern konnte durch eine starke Absenkung der Expressionsrate vermieden werden. Eine Amino-terminale Veränderung des Enzymes durch das Hinzufügen eines Hexa-Histidine Markers (HPL3626) hatte keinen negativen Effekt auf die enzymatische Aktivität und erlaubte eine Aufreinigung mittels Nickel-Chelat Affinitätschromatographie. Das Endolysin Ply3626 besteht aus einer N-terminalen Amidase Domäne und einem C-terminalen Bereich, welcher möglicherweise für die spezifische Erkennung der C. perfringens Zellwand verantwortlich ist. Lebende Zellen von 48 getesteten C. perfringens Stämme waren sensitiv gegenüber der Murein Hydrolase, hingegen zeigten andere Clostridien Arten generell keine Sensitivität, und auch andere Bakterien waren nicht sensitiv. Diese hohe Spezifität von Ply3626 gegenüber C. perfringens ist von hohem Wert für nun mögliche Anwendungen, zum Beispiel die Entwicklung neuer biologischer Maßnahmen zur Kontrolle der Entwicklung von C. perfringens in Lebensmitteln, Futtermitteln oder auch komplexen mikrobiellen Lebensgemeinschaften.
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