In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Bilin-Bindungsprotein (BBP), ein Mitglied der Lipocalin-Proteinfamilie, strukturell derart umgestaltet werden kann, daß es das cardioaktive Steroid Digoxigenin, welches neuerdings zunehmend auch in der Bioanalytik zur nicht-radioaktiven Markierung von Proteinen und Nukleinsäuren eingesetzt wird, als Liganden erkennt. Innerhalb der vier Peptidschleifen, die den Eingang zur Bindungstasche des BBP für seinen natürlichen Liganden, Biliverdin IX?, ausbilden, wurden insgesamt sechzehn Aminosäuren einer Zufallsmutagenese unterworfen. Die resultierende Bibliothek wurde zur Selektion Digoxigenin bindender Varianten mittels Phage Display an einer mit Digoxigenin funktionalisierten Polystyroloberfläche eingesetzt. Die selektierten BBP-Varianten wurden zur Untersuchung ihrer individuellen Liganden-Bindungseigenschaften einem Kolonie-Filterstapel-Test unterzogen. Hierfür wurde ein spezialisierter Vektor konstruiert, der die Sekretion der Lipocalin-Varianten als Fusionsprotein mit einer bakteriellen Albumin-Bindungsdomäne (ABD) am C-Terminus erlaubt. So ausgestattet konnten die rekombinanten Proteine - nach Exkretion aus den E. coli-Kolonien - auf der Oberfläche einer mit humanem Serumalbumin beschichteten Membran örtlich immobilisiert und anschließend auf ihre Affinität zu Digoxigenin funktionell untersucht werden. Auf diese Weise wurde das Anticalin DigA isoliert, welches an fünfzehn der insgesamt sechzehn randomisierten Positionen eine vom Wildtyp-BBP verschiedene Aminosäure aufwies. Das in E. coli löslich produzierte und gereinigte Protein komplexierte Digoxigenin selektiv mit einer Dissoziationskonstante (KD) von 295 ± 37 nM. Zum Zweck einer In vitro-Affinitätsmaturierung wurde ausgehend von DigA durch ortsgerichtete Randomisierung der ersten Peptidschleife eine weitere Molekülbibliothek hergestellt und mittels Phage Display der Selektion auf Digoxigenin-Bindung mit funktionalisierten paramagnetischen Partikeln unterworfen. Nach anschließendem Kolonie-Filterstapel-Test wurde das Anticalin DigA16 isoliert. Das in E. coli produzierte Protein wurde einer detaillierten Analyse der Bindungseigenschaften durch Fluoreszenztitration mit verschiedenen Liganden unterzogen. DigA16 besitzt zehnmal höhere Affinität für die Digoxigenin-Gruppe mit einer KD von 30,2 ± 3,6 nM. Die molekulare Erkennung erwies sich dabei als unabhängig vom jeweiligen Substituenten an der Position C-3 des Steroid-Rings, was auch in ELISA-Experimenten bestätigt werden konnte. Digitoxigenin, das sich von Digoxigenin nur durch eine fehlende Hydroxylgruppe an der Position C-12 des Steroid-Gerüsts unterscheidet, wird mit einer KD von 2,0 ± 0,52 nM, also nochmals deutlich höherer Affinität, komplexiert. Dagegen werden 4-Aminofluorescein sowie die dem Digoxigenin strukturell sehr ähnlichen Steroide Testosteron und Ouabain nicht gebunden. Lediglich Progesteron wird mit einer noch nachweisbaren KD von ca. 0,1 µM komplexiert. Für den Versuch einer weiteren Verbesserung der Affinität wurden nun ausgehend von DigA16 durch Zufallsmutagenese in den Schleifenbereichen Nr. 3 und 4 zwei weitere Molekülbibliotheken hergestellt und gemeinsam zur Affinitätsanreicherung eingesetzt. Von den acht nach dem Kolonie-Filterstapel-Test isolierten unterschiedlichen BBP-Varianten, von denen sieben aus derjenigen Bibliothek mit der randomisierten Schleifenregion Nr. 4 stammten, wurden die Bindungseigenschaften des Anticalins DigA16/19 durch Fluoreszenztitration näher untersucht. Hierbei zeigte sich, daß sich die Affinität zu Digoxigenin mit einer KD von 12,4 ± 1,3 nM im Vergleich zu DigA16 nochmals mehr als verdoppelt hatte, während die KD für Digitoxigenin nahezu unverändert geblieben war. Die Glycosid-Derivate der beiden Steroide, Digoxin bzw. Digitoxin, werden durch DigA16/19 allerdings beide etwa viermal schlechter komplexiert als die entsprechenden Aglycone, was zeigt, daß dieses Anticalin im Gegensatz zu DigA16 zwischen den Substituenten an der Position C-3 des Steroidgerüsts unterscheiden kann. Die BBP-Varianten DigA16 und DigA16/19 wurden zusammen mit dem aus früheren Arbeiten des Labors stammenden Fluorescein-bindenden FluA für die Konstruktion sogenannter Duocaline eingesetzt, einer neuen Klasse von Fusionsproteinen, die aus zwei Anticalinen mit unterschiedlicher Liganden-Spezifität besteht. Die in E. coli produzierten Fusionsproteine zeigten im ELISA wie auch in Fluoreszenztitrations-Experimenten die Fähigkeit, sowohl Digoxigenin als auch Fluorescein zu komplexieren. Somit wurde gezeigt, daß Duocaline bispezifische Rezeptorproteine mit zwei unabhängigen Bindungsfunktionen darstellen. Die Anticaline DigA16 und DigA16/19 wurden auch mit der bakteriellen Alkalischen Phosphatase (PhoA) fusioniert - sowohl am C- als auch am N-Terminus - und die gentechnisch produzierten Proteine wurden zum Nachweis der Digoxigenin-Gruppe in ELISA-Experimenten und im Western Blot eingesetzt. Dabei konnte gezeigt werden, daß sich die bifunktionellen Fusionsproteine zur Detektion der Digoxigenin-Gruppe mit konventionellen chromogenen Substanzen einsetzen lassen. Aus den Experimenten wurde weiterhin ersichtlich, daß sich beide Polypeptidtermini der Anticaline in vergleichbarer Weise zur Fusionierung mit anderen Proteinen eignen. In der vorliegenden Arbeit wurde somit einerseits der Einsatz der Anticaline als praktisch anwendbares Nachweisreagenz für niedermolekulare Substanzen und andererseits ihre Eignung zur Konstruktion bispezifischer Bindungsproteine demonstriert. Aufgrund ihrer gegenüber den Antikörpern vorteilhaften Eigenschaften, wie der geringeren Größe und ihrer Zusammensetzung aus nur einer einzigen Polypeptidkette, stellen die Anticaline neuartige attraktive Reagenzien vor allem für die Bioanalytik und Diagnostik dar.     «

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß das Bilin-Bindungsprotein (BBP), ein Mitglied der Lipocalin-Proteinfamilie, strukturell derart umgestaltet werden kann, daß es das cardioaktive Steroid Digoxigenin, welches neuerdings zunehmend auch in der Bioanalytik zur nicht-radioaktiven Markierung von Proteinen und Nukleinsäuren eingesetzt wird, als Liganden erkennt. Innerhalb der vier Peptidschleifen, die den Eingang zur Bindungstasche des BBP für seinen natürlichen Liganden, Biliverdin IX?, ausbi...     »

This work demonstrates that the bilin-binding protein (BBP), a member of the lipocalin family of proteins, can be structurally reshaped in order to specifically complex the cardioactive steroid ligand digoxigenin, which is commonly used for the non-radioactive labelling of proteins and nucleic acids. Sixteen amino acid positions within the four loops that form the binding pocket for biliverdin IX?, the natural ligand of the BBP, were subjected to targeted random mutagenesis. The resulting library was employed for affinity-selection experiments against immobilized digoxigenin using phage display and the selected BBP variants were analyzed in a filter-sandwich colony screening-assay. A specialized vector was constructed allowing for the secretion of lipocalin variants C-terminally fused to a bacterial albumin-binding domain (ABD). This domain was used to immobilize excreted fusion proteins on top of a membrane coated with human serum albumin. The functionally captured lipocalin variants were then tested for dioxigenin affinity. This assay resulted in the identification of the BBP variant called DigA, an anticalin. DigA contains altered amino acid residues at 15 out of the 16 initially selected positions. DigA was produced in E. coli in a soluble form and was shown to complex digoxigenin with a dissociation constant (KD) of 295 ± 37 nM. To perform an in vitro affinity maturation, a second library based on the anticalin DigA was produced by targeted random mutagenesis of only one peptide loop and subjected to phage display selection. Employing the filter-sandwich colony screening-assay a new anticalin, DigA16, was isolated, produced in E. coli and tested for the binding of different ligands in fluorescence titration assays. DigA16 shows a tenfold higher affinity to digoxigenin with a KD of 30.2 ± 3.6 nM. ELISA experiments confirmed that the molecular recognition was thereby independent of the substituent at position C-3 of the steroid system. Digitoxigenin, which lacks a hydroxyl group at C-12 compared to digoxigenin, is complexed by DigA16 with an approximately 15-fold higher affinity (KD = 2.0 ± 0.52 nM). 4-aminofluorescein as well as the steroids testosterone and ouabain, which are structurally closely related to digoxigenin, were all not bound by DigA16. Only progesterone was complexed with a measurable KD (of 0.1 µM). An attempt was made to further improve the affinity of DigA16 to digoxigenin. Therefore two libraries based on this anticalin were constructed by targeted random mutagenesis of either loop No. 3 or 4 and jointly employed for affinity enrichment. Seven out of eight clones, which were selected after a filter-sandwich colony screening-assay, originated from the library containing mutations in loop No. 4. One of them, DigA16/19, was subjected to detailed binding studies by fluorescence titration, which revealed a twofold increase in the affinity to digoxigenin with a KD of 12.4 ± 1.3 nM, whereas the KD for digitoxigenin remained almost unchanged. The glycoside derivatives, digoxin and digitoxin, showed a 4-fold reduction in their affinity to DigA16/19, when compared to their aglycones. This demonstrates the capability of DigA16/19 to distinguish between different substituents at position C-3 of the steroid system. The BBP variants DigA16 and DigA16/19 were, together with FluA that originated from earlier work in our research group, employed for the construction of heterodimers. This novel class of fusion proteins, the so called duocalins, are composed of two anticalins with different specificities. The duocalins were produced in E. coli and shown to bind their particular ligands digoxigenin (DigA16; DigA16/19) and fluorescein (FluA), respectively in ELISA as well as in fluorescence titration experiments. Therefore duocalins constitute bispecific receptor proteins comprising independent binding specificities. To test whether conventional chromogenic reagents could be used to detect digoxigenin, the anticalins DigA16 and DigA16/19 were fused with bacterial alkaline phosphatase (PhoA) at either end of their polypeptide chain. Both, in ELISA experiments and Western blot assays, it could be demonstrated that the fusion proteins were functional and allowed the detection of digoxigenin taking advantage of the enzymatic activity of PhoA. Furthermore, it was shown that N- and C-termini are both equally suitable for protein fusion. This work emphasizes the use of anticalins as a practically applicable tool for the detection of low molecular weight substances and their suitability for the construction of bispecific receptor proteins. Based on their favourable properties compared to antibodies, e.g. their smaller size and their composition of a single polypeptide chain, anticalins could become novel and attractive reagents particularly for bioanalytical and diagnostic applications.     «

This work demonstrates that the bilin-binding protein (BBP), a member of the lipocalin family of proteins, can be structurally reshaped in order to specifically complex the cardioactive steroid ligand digoxigenin, which is commonly used for the non-radioactive labelling of proteins and nucleic acids. Sixteen amino acid positions within the four loops that form the binding pocket for biliverdin IX?, the natural ligand of the BBP, were subjected to targeted random mutagenesis. The resulting librar...     »