Den Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Messung von Biegesteifigkeiten an Mikrotubuli unter standardisierten Bedingungen mit Hilfe einer optischen Falle. Dabei wurde sowohl die Wirkung des Nukleotides AMP-PNP nach erfolgter Polymerisation mit GTP, als auch der Einfluß von Konstrukten des Motormoleküles Kinesin aus dem Organismus Neurospora crassa als Bindepartner, untersucht. Für eine dichte Belegung (Dekoration) des Mikrotubulus mit Kinesinkonstrukten wurden diese mit AMP-PNP in rigor gebunden. Dabei kamen drei verschiedene Konstrukte zum Einsatz. Neben dem dimeren Vollängen-Protein ein stark verkürztes Konstrukt, das nur noch aus der katalytischen Domäne besteht und daher monomer ist, sowie ein Konstrukt, das das Scharnier enthält und daher dimerisiert. Durch AMP-PNP wurde die Biegesteifigkeit mehr als verdoppelt (von 2,3 * 10-24 Nm2 auf 6,1 * 10-24 Nm2). Im Vergleich der Biegesteifigkeiten zwischen der Referenz (AMP-PNP) und gebundenem Konstrukt läßt sich kein statistisch relevanter Unterschied feststellen. Im Vergleich der Konstrukte untereinander sind jedoch deutliche Unterschiede der Wirkung auf die Mikrotubuli zu sehen. So weist das verkürzte dimere Konstrukt eine Tendenz auf, die Biegesteifigkeit zu reduzieren (4,2 * 10-24 Nm2), während sowohl die Bindung des monomeren Konstruktes (9,2 * 10-24 Nm2) als auch das Vollängen-Konstrukt (11,6 * 10-24 Nm2) die Mikrotubuli tendenziell steifer macht. Neben diesen Messungen wurden Strukturuntersuchungen am Schwanzbereich des Kinesin durchgeführt. Dabei bestand die Zielsetzung darin, die Stabilität und Lage von superhelikalen Sequenzabschnitten zu bestimmen. Als Instrument hierzu wurde ein Kraftspektrometer verwendet. Eigens für diese Untersuchungen wurden Titin-Kinesin-Chimären kloniert. Die Titin-Domänen wurden wegen ihrer leichten Identifizierbarkeit in Meßkurven gewählt. Zudem sind sie kraftspektroskopisch gut erforscht. Eine räumlich aufgelöste Messung der Stabilität von superhelikalen Strukturen war wegen eines starken Haftens des Kinesinschwanzes auf der Unterlage nicht möglich. Es konnte jedoch eine Obergrenze für die Stabilität der superhelikalen Strukturen von 15 pN bestimmt werden. Des weiteren konnte ein nicht näher charakterisiertes, aus wenigen Aminosäuren bestehendes, Strukturelement identifiziert werden, das bei einer Kraft von etwa 30 pN aufbricht.
Translated abstract:
The main focus of the thesis is set on the measurement of bending stiffnesses of microtubuli with an optical trap under standardized conditions. The effect of the presence of the nucleotide AMP-PNP after polymerization with GTP was as well examined as different constructs of the motor molecule kinesin of the organism Neurospora crassa as a binding partner. In order to get a dense occupation (decoration) of the microtubulus the constructs were bound in rigor by the nucleotide AMP-PNP. Three different constructs were used. Besides the dimeric complete protein a monomeric construct solely consisting of the catalytic domain was used. The third construct consisted of the catalytic domain as well as a hinge domain and thus was dimeric. The presence of AMP-PNP lead to an more then two-fold increase in the rigidity from 2.3 * 10-24 Nm2 to 6.1 * 10-24 Nm2. In comparison to the rigidity of the reference (AMP-PNP) no statistically relevant difference is detectable with bound constructs. Comparison of the different constructs to one another shows clearly distinguishable differences in the effect on the microtubules. The truncated dimeric construct shows a tendency to weaken the bending stiffness (4.2 * 10-24 Nm2) while both the monomeric construct (9.2 * 10-24 Nm2) and the complete protein (11.6 * 10-24 Nm2) tend to increase the rigidity of microtubules. Additional to these measurements structural examinations of the kinesin tail were carried out. The target was to spot the stability and position of coiled-coil stretches in the sequence. The used method was atomic force spectrometry. Especially for these investigations chimaera of titin and kinesin were cloned. Titin domains were chosen because they were already well investigated with the force spectrometer and they are easy to identify in the measurements. Spacially resolved measurements of the stability of coiled-coil structures was not possible due to the strong adhesion of the kinesin tail to the surface. An upper limit of the stability of coiled-coil structures could be determined though and was fixed at 15 pN. Additionally a small and not further characterized structure consisting of only a few amino acids could be identified. It ruptures at a force of about 30 pN.
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