The interaction of conotoxins with voltage gated ion channels:influence of membrane potential and ionic milieu on the binding of k-conotoxin PVIIA to Shaker K-channels
Übersetzter Titel:
Die Interaktion von Conotoxinen mit spannungsabhängigen Ionenkanälen: Einfluß des Membranpotentials und des Ionenmilieus auf die Bindung von k-conotoxin PVIIA an Shaker Kaliumkanäle
Gen shaker; Genprodukt; Bindeproteine; Wechselwirkung
TU-Systematik:
PHY 821d; PHY 823d; CHE 820d
Kurzfassung:
Ion channels are integral membrane proteins present in almost all cells and assure selective and high rate transport of ions down the electrochemical gradient. Voltage gated ion channels respond to a depolarization of the membrane potential with a conformational change that opens a permeation pathway for ions. Within this family, K+ channels, which are selectively permeable to K+-ions, are the biggest group and are a requisite for a variety of physiological functions. Due to their functional importance for the electrical excitability of cells, diverse organisms such as scorpions, anemones, snakes and snails have developed highly specific toxins targeting voltage gated K+ channels of their prey. Some of these toxins have been successfully used as probes for investigating the structure and function of ion channels (for review, Hille 1992). k-conotoxin PVIIA (k-PVIIA), isolated from the fish-hunting snail Conus purpurascens, blocks Shaker K+ channels (Terlau et al. 1996), by strongly interacting with some amino acid residues that are believed to shape the outer pore (Shon et al. 1998). In this study we investigated the blocking mechanism by k-PVIIA and the parameters that influence the binding of this peptide to the ion channel protein. Since ion channels are not a rigid structure and they undergo conformational changes during their activity, we investigated the possibility that this might affect, directly or indirectly, i.e. through ion(s) sitting in the pore, the binding of the toxin. The main results of this study are: k-PVIIA binds to Shaker K+-channel with a 1:1 stoichiometry (Garcia et al. 1999, Terlau et al. 1999), but blocks differently the channel in the conductive than in the not conductive state, which can be either the closed or N-type inactivated state (Terlau et al. 1999). The potency of toxin block of Shaker channels in the open conformation decreases with increasing potentials. This feature reflects a destabilization of the toxin due to a K+ ion bound in the pore: toxin dissociation from the K+-occupied channel increases at higher depolarizations and is faster than from channels not occupied by K+. When K+ is the only permeant cation in solution, the binding properties of k-PVIIA to open channels are affected only by the composition of the intracellular solution. Accordingly, in the presence of impermeant cations in the intracellular medium, the efficiency of the toxin is increased, due to a lower probability for a K+ in the pore to efficiently destabilize the toxin. Nevertheless in the presence of bulky non permeant cations, a residual voltage dependence of the toxin block is observed. In addition Na+ acts like K+ in destabilizing the bound toxin, which might indicate that this poorly permeant ion (it is permeable in absence of K+) traverses a substantial length of the pore. Since K+-channels are multi ion pores it is likely that when the toxin is bound, more ions can be present in the pore. Consequently the ion interfering with toxin binding would be the one located at the outer position, in most cases a K+, and its destabilizing action would reflect a cooperative movement of all the ions present in the pore. Our results suggest that the movement of the inner ion, maybe within the cavity, accessible to impermeant ions as well, influences the probability of K+ to be in the outer position, from which it is more effective in repelling the toxin. Alternatively, the toxin could sense a small fraction of the voltage drop across the pore. In contrast to these findings observed for open channel binding, the properties of the binding of k-PVIIA to closed channels are exclusively determined by the extracellular solution. This indicates that when the toxin is bound the probability that the channels open is very low. Toxin efficiency decreases at increasing potassium concentrations, suggesting the presence of an external K+-selective site near the toxin receptor in the channel vestibule, which interferes with toxin binding. When the permeant Rb+ is present in the extracellular and/or intracellular solutions, the toxin block appears to be modified. k-PVIIA blocks closed channels 2-3 times better when Rb+ instead of K+ is trapped by the toxin. For the open channel block, the complicated pattern of toxin efficiencies in all the various solutions used suggests not only that the toxin interacts differently with the two ions, but it is also likely that the occupancy of the pore is different depending on the permeating species. In comparison to the case in which K+ is the only permeant ion, open channel block is strongly reduced, approximately 7 fold at 0 mV, when Rb+ is present in the extracellular solution and Rb ions are flowing, independently on the composition of the intracellular media. This situation corresponds most likely to the presence of two Rb ions in the pore and seems to be the most destabilizing configuration for the toxin. We conclude that k-PVIIA can be successfully used as a probe to elucidate the permeation properties of voltage gated K+ channels and therefore is an useful tool in understanding the pharmacology and physiology of K+-channels
Übersetzte Kurzfassung:
Ionenkanäle sind integrale Membranproteine nahezu aller Zellen und dienen dem schnellen, selektiven Transport von Ionen entlang des elektrochemischen Gradienten. Spannungsabhängige Ionenkanäle reagieren auf eine Depolarisation mit einer Konformationsänderung, die zur Bildung einer Pore für Ionen führt. Innerhalb dieser Familie stellen Kaliumkanäle, welche selektiv permeabel für Kalium sind, die größte Gruppe mit einer Vielzahl von physiologischen Funktionen. Aufgrund der besonderen Bedeutung dieser Proteine für die elektrische Erregbarkeit von Zellen sind von verschiedensten giftigen Organismen wie z.B. Skorpionen, Schlangen oder auch Schnecken hochspezifische Toxine evolviert worden, die mit spannungsabhängigen Kaliumkanälen des Opfers interagieren. Einige dieser Toxine wurden erfolgreich zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Ionenkanälen eingesetzt (zur Übersicht, Hille, 1992). < font face=" Symbol" > k< /font> -conotoxin PVIIA (< font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA), ein Peptid, welches aus der Fisch-fangenden Schnecke Conus purpurascens isoliert wurde (Terlau et al., 1996), blockiert sogenannte Shaker Kaliumkanäle durch eine Interaktion mit Aminosäuren, die den äußeren, extrazellulären Bereich der Pore des Ionenkanales bilden (Shon et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Blockierung des Ionenstromes durch < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA und die für die Bindung des Peptides an den Ionenkanal wichtigen Parameter untersucht. Da Ionenkanäle Konformationsänderungen während ihrer Aktivität durchführen, wurde untersucht, inwieweit dies, direkt oder indirekt, wie z.B. aufgrund von Bindung von Ionen innerhalb der Pore, die Bindung des Toxins beeinflusst. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Untersuchung sind: < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA bindet an den Shaker Kaliumkanal mit einer 1:1 Stöchiometrie (Garcia et al., 1999; Terlau et al., 1999), die Blockierung ist jedoch für den permeierenden und nicht-permeierenden Zustand des Kanalproteins verschieden, wobei der nicht-permeierende entweder der geschlossene oder der N-Typ inaktivierte Zustand ist (Terlau et al., 1999). Die Blockierung des Kanalproteins im offenen Zustand nimmt mit höheren Testpotentialen ab. Dies lässt sich auf eine Destabilisierung der Toxinbindung aufgrund eines in der Pore gebundenen Kaliumions zurückführen: Die Dissoziation des Toxins in Anwesenheit dieses Kaliumions ist schneller und nimmt mit zunehmender Depolarisation zu. Ist Kalium das einzige permeirende Kation, so wird die Bindung von < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA an den Kanal im offenen Zustand nur durch die Zusammensetzung der intrazellulären Lösung bestimmt. Entsprechend führt die Gegenwart von nicht-permeierenden Ionen im intrazellulären Medium zu einer Erhöhung der Affinität des Toxins, die auf eine geringere Wahrscheinlichkeit der Destabilisierung des gebundenen Toxins durch Kalium zurückzuführen ist. Trotzdem ist in Gegenwart von großen, nicht-permeirenden Kationen eine Spannungsabhängigkeit in der Blockierung durch das Toxin festzustellen. Zusätzlich kann Natrium - ähnlich wie Kalium - zu einer Destabilisierung des gebundenen Toxins führen. Dies weist darauf hin, dass Natrium als schlecht permeierendes Ion (Natrium ist permeabel in Abwesenheit von Kalium) in einen substantiellen Teil der Pore eindringen kann. Da es sich bei Kaliumkanälen um sogenannte Multiionenporen handelt, ist es wahrscheinlich, dass bei Bindung des Toxins an den Ionenkanal sich mehrere Ionen in der Pore befinden können. Ferner ist wahrscheinlich, dass es sich bei dem mit der Toxinbindung wechselwirkenden Ion - in der Regel Kalium - um das Ion handelt, welches sich auf der extrazellulären Seite der Pore befindet und dass die destabilisierende Wirkung eine gleichzeitige Bewegung aller in der Pore befindlichen Ionen widerspiegelt. Die in dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Bewegung des Ions auf der inneren Seite der Pore die Wahrscheinlichkeit des Kaliums sich in der äußeren Position zu befinden, in welcher es zu einer effektiven Abstoßung des Toxins kommt, beeinflusst. Alternativ könnte das positiv geladene Toxin auf einen bestimmten Teil des Spannungsabfalls entlang der Pore reagieren. Im Gegensatz zur Bindung an den offenen Zustand des Kanalproteins ist die Bindung von < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA an den geschlossenen Zustand ausschließlich durch die Zusammensetzung der Extrazellulärlösung determiniert. Dies weist darauf hin, dass die Wahrscheinlichkeit des Kanalproteins zu öffnen bei Bindung des Toxins an den geschlossenen Zustand sehr gering ist. Die Affinität des Toxins für den geschlossenen Zustand nimmt mit steigender Kaliumkonzentration ab, was auf eine Kalium-selektive Bindestelle in der Nähe des Toxinrezeptors hindeutet und zeigt, dass Kaliumbindung mit der Toxinbindung interferiert. Die Bindung des Toxins an das Kanalproteins ist verändert, wenn sich Rubidium als einziges permeierendes Kation auf der intra- und/oder extrazellulären Seite befindet. < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA blockiert den geschlossenen Zustand des Proteins 2-3-mal besser, wenn Rubidium anstelle von Kalium durch die Toxinbindung in der Pore eingeschlossen wird. Das komplizierte Verhalten der Toxin-Affintät bei der Blockierung des offenen Zustands des Ionenkanals in Abhängigkeit der verschiedenen getesteten ionalen Bedingungen weist darauf hin, dass nicht nur das Toxin unterschiedlich mit Rubidium und Kalium interagiert, sondern dass zusätzlich die Aufenthaltswahrscheinlichkeiten dieser Ionen innerhalb der Pore unterschiedlich ist. Verglichen mit Kalium als alleinigem permeierenden Kation ist die Blockierung des offenen Zustands des Kanalproteins in Gegenwart von Rubidium in der Extrazellulärlösung bei Rubidiumionenfluß bei 0 mV etwa 7-fach reduziert. Dieser Effekt ist unabhängig von der Zusammensetzung der Intrazellulärlösung. Unter diesen Bedingungen befinden sich wahrscheinlich zwei Rubidiumionen in der Pore, was offensichtlich der am meisten destabilisierte Zustand für die Toxinbindung darstellt. Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, dass < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA erfolgreich als Probe für die Untersuchung der Permeationseigenschaften von spannungsabhängigen Kaliumkanälen eingesetzt werden kann und somit ein hilfreiches Werkzeug für das Verständnis der Pharmakologie und Physiologie von Kaliumkanälen darstellt
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