Die vorgelegte Arbeit beschreibt den Einfluss von RNA-Struktur-Determinanten auf die heterologe bakterielle Gen-Expression. Heterologe Proteinsynthese ist in den letzten Jahren eine der wichtigsten Methoden in der Biotechnologie geworden. Nachdem die Genome der unterschiedlichsten Organismen sequenziert worden sind, ist die Expression der Gene, und damit die Synthese der jeweiligen Proteine zur Erforschung ihrer Strukturen und Funktionen für zukünftiges Verständnis molekularbiologischer und biochemischer Zusammenhänge von immenser Wichtigkeit. In diesem Zusammenhang sind die technologischen Ansprüche auf Hochdurchsatzverfahren, sowie die biotechnologische Produktion pharmazeutischer Wirkstoffe, wie z.B. die rekombinante Insulin-Produktion, konzentriert. Die Überexpression rekombinanter Proteine hängt von verschiedenen Faktoren ab, für die viele Strategien zur Steigerung entwickelt wurden. Der entscheidende Schritt bei der bakteriellen Translation ist die Ausbildung des Pre-Initiationskomplexes. Seine Ausbildung erfordert erste Kontakte zwischen mRNA, Initiator-tRNA und der 30S-Untereinheit des Ribosoms, wodurch die Initiation der Translation limitiert wird. In diesem Kontext beschreibt die Arbeit die Expression einiger als Wildtyp-Varianten nicht exprimierbarer Gene. Die Translationsinitiation dieser Gene wurde optimiert, indem ein synthetischer RNA-Stem-Loop (7bp stem length; DG0 = - 9,9 kcal/mol) 15 Nukleotide abwärts vom Start-Kodon vor den Gen-Sequenzen platziert wurde. Die Einführung der RNA-Sekundärstruktur ermöglichte die in vitro Expression von fünf vorher nicht exprimierbaren Genen und verbesserte die Expression bei allen weiteren untersuchten Genen. Die RNA-Strukturuntersuchungen zeigten die Ausbildung des RNA-Stem-Loops im Gen-Kontext. Ferner zeigten sie, dass das Einbringen des RNA-Stem-Loops zur Stabilisierung der Ribosomenbindestelle führte. Die theoretische RNA-Strukturberechnung zeigte die Fähigkeit des eingebrachten RNA-Stem-Loops Abwärtspaarungen der Ribosomenbindestelle und des Start-Kodons mit gen-spezifischen mRNA Sequenzen zu unterdrücken. Folglich stabilisierte das Einbringen des RNA-Stem-Loops die Ausbildung einer separaten Translationsinitiationsdomäne, die für die Ribosomen zur Initiation gut zugänglich ist. Ferner wurde untersucht, inwieweit die erfolgreiche Expression der schwer exprimierbaren Gene von der Stabilität und der Größe des RNA-Stem-Loops abhängt. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass der Expressionserfolg unter Einsatz kürzerer RNA-Stem-Loops (2 bis 6 bp Stammlänge) stark vom Gen abhängt, wobei bei Verwendung des 7bp-Stem-Loops bei allen untersuchten Genen die höchsten Expressionsergebnisse detektiert wurden. Neben diesen Untersuchungen wurde der Einfluss RNA-strukturschwächender Reagenzien auf die in vitro Proteinexpression untersucht.     «

Die vorgelegte Arbeit beschreibt den Einfluss von RNA-Struktur-Determinanten auf die heterologe bakterielle Gen-Expression. Heterologe Proteinsynthese ist in den letzten Jahren eine der wichtigsten Methoden in der Biotechnologie geworden. Nachdem die Genome der unterschiedlichsten Organismen sequenziert worden sind, ist die Expression der Gene, und damit die Synthese der jeweiligen Proteine zur Erforschung ihrer Strukturen und Funktionen für zukünftiges Verständnis molekularbiologischer und bioc...     »

The work presented here describes the influence of RNA structure determinants on heterologous bacterial gene expression. Heterologous synthesis of proteins have become one of the most important tools in biotechnology during the last years. Since the genomes of several organisms are sequenced, the expression of their genes, and therefore the synthesis of their respective proteins to investigate their structures and functions, is of key importance to understand molecular and biochemical mechanisms. In this context the technological demands are focused on high-through put methods and biotechnology production of pharmaceuticals, like recombinant Insulin. High-level synthesis of recombinant proteins depends on different factors, for which many strategies were developed to reach high expression rates. The key step in bacterial translation is the formation of the pre-initiation complex. This requires first contacts between mRNA, fMet-tRNA and the 30S subunit of the ribosome which limits the initiation of translation. In this context, the expression of several previously non-expressible genes is reported here. The translation initiation of these genes was improved by introducing a synthetic RNA-stem-loop (7bp stem length; DG0 = - 9.9 kcal/mol) 15 nucleotides downstream of the start codon, in front of the gene sequences. Stem-loop introduction enabled in vitro expression of five previously non-expressible genes and enhanced the expression of all other genes investigated. RNA structure analysis proved the formation of the stem-loop in gene context. Further it demonstrated that the stabilisation of the ribosome binding site is the consequence of stem-loop introduction. The theoretical RNA structure analysis showed the capacity of the introduced RNA-stem-loop to suppress long range interactions of the ribosome binding site and the start-AUG with gene specific mRNA sequences. Thus, the introduced RNA-stem-loop stabilises the formation of a separate translational initiation domain with increased accessibility for ribosomal initiation. Further the dependency of successful expression of hardly expressible genes on stability and size of the introduced RNA-stem-loop was investigated. In this context it was shown, that the successful expression by using shorter RNA-stem-loops (2 to 6 bp stem-length) depends strongly on the gene. Hereby the use of the 7 bp-stem-loop showed the highest expression rates in all genes investigated. In additional experiments the influence of substances, that weaken RNA structures, on in vitro expression was investigated.     «

The work presented here describes the influence of RNA structure determinants on heterologous bacterial gene expression. Heterologous synthesis of proteins have become one of the most important tools in biotechnology during the last years. Since the genomes of several organisms are sequenced, the expression of their genes, and therefore the synthesis of their respective proteins to investigate their structures and functions, is of key importance to understand molecular and biochemical mechanisms...     »