Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des PCNA-Homologen aus dem Archaeum Pyrococcus furiosus (Pfu-PCNA) bestimmt und die katalytische Untereinheit der DNA-Primase aus Pyrococcus furiosus (Pfu-Prim) identifiziert sowie ihre Kristallstruktur ermittelt. Pfu-PCNA besitzt funktionelle und strukturelle Homologie zu den Prozessivitätsfaktoren von DNA-Polymerasen aus Bakterien, Bakteriophagen und Eukaryonten. Im Kristall bildet es ein kristallographisches Trimer und entspricht darin dem ebenfalls trimeren eukaryontischen PCNA und der sliding-clamp aus Bakteriophagen, nicht jedoch der nur dimeren beta-Untereinheit der bakteriellen DNA-Polymerase III. Im Vergleich zu PCNA aus Mensch und Bäckerhefe enhält Pfu-PCNA zwei verkürzte loop-Regionen sowie eine erhöhte Anzahl an intramolekularen Ionen-Paaren, was ursächlich für seine erhöhte Thermostabilität sein könnte. Die katalytische Untereinheit der DNA-Primase aus Pyrococcus furiosus ist die erste vollständige Primase mit bekannter 3D-Struktur. Keine der beiden Domänen in der Struktur von Pfu-Prim zeigt Ähnlichkeit zu bekannten Faltungsmotiven, womit Pfu-Prim eine neue Familie in der SCOP-Datenbank definiert. Die active site-Domäne enthält alle innerhalb der prim-Typ-Primasen konservierten Aminosäuren, darunter drei invariante negativ geladene Reste, welche als essentiell für die Aktivität von Maus-Primase identifiziert worden waren. Die dreidimensionale Anrodnung dieser drei Aminosäuren entspricht der katalytischen Triade von DNA-Polymerasen, was auf einen ähnlichen Mechanismus während des Nukleotidyltransfers schließen läßt. Pfu-Prim enthält ein Zinkknöchel-Motiv, welches vermutlich eine funktionelle Rolle spielt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Kristallstruktur der humanen mitochondrialen tRNA-Nukleotidyltransferase (hmtCCase, CCA-adding enzyme) gelöst. Die Struktur der hmtCCase zeigt in ihrem definierten Bereich einen Aufbau aus drei Domänen, wobei die N-terminale Domäne strukturelle Homologie zur Familie der Kanamycin-Nukleotidyltransferasen zeigt und das aktive Zentrum beinhaltet. Die intermediäre Domäne ist Sitz des Protein-templates, welches in der Lage ist, innerhalb einer Bindungs-Stelle sowohl CTP als auch ATP zu binden. Aus Struktur-Vergleichen mit der strukturell homologen DNA-Polymerase beta konnte ein Modell für die CCA-Addition entwickelt werden. Dieses „Korkenzieher“-Modell ist mit sämtlichen bekannten biochemischen Daten kompatibel und beinhaltet die Bindung eines in der Struktur ungeordneten Bereichs innerhalb der N-terminalen Domäne an das tRNA-Substrat.     «

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des PCNA-Homologen aus dem Archaeum Pyrococcus furiosus (Pfu-PCNA) bestimmt und die katalytische Untereinheit der DNA-Primase aus Pyrococcus furiosus (Pfu-Prim) identifiziert sowie ihre Kristallstruktur ermittelt. Pfu-PCNA besitzt funktionelle und strukturelle Homologie zu den Prozessivitätsfaktoren von DNA-Polymerasen aus Bakterien, Bakteriophagen und Eukaryonten. Im Kristall bildet es ein kristallographisches Trimer und entspricht darin d...     »

In the first part of this work, the crystal structures of proliferating nuclear antigen (Pfu-PCNA) and the catalytic domain of the DNA primase of Pyrococcus furiosus (Pfu-prim) were determined. Pfu-PCNA shows funktional and strukturall homology to processivity factors of DNA polymerases from bacteria, bacteriophages and eucaryotes. In the crystal it forms a crystallographic trimer and resembles the trimeric eucaryotic PCNA and the sliding-clamp of bacteriophages but not the dimeric beta-subunit of bacterial DNA polymerase III. In comparison with eucaryotic PCNA, Pfu-PCNA contains two shortened loop-regions and an increased number of intermolecular ion pairs which might be responsible for its increased thermal stability. The catalytic domain of Pyrococcus furiosus DNA-primase is the first complete primase with known 3D-structure. Non of the two primase-domains shows a known fold and Pfu-prim defines a novel family in the SCOP-database. The active-site domain contains all amino acids invariant in the prim-type family, including three negatively charged residues that have been identified as essential for activity of mouse primase. The threedimensional architecture resembles the catalytic triad of DNA polymerases and suggests a similar catalytic mechanism of nucleotidyltransfer. Pfu-prim contains a zinc knuckle which might be functionally rather than structurally important. In the second part of the work, the structure of the human CCA-adding enzyme was determined. The enzyme shows a three-domain arrangement, with the N-terminal domain being a member of the kanamycin-nucleotidyltransferase family and containing the active site. The intermediate domain forms the protein-template which recognizes CTP and ATP within one binding site. Structural comparison with DNA polymerase beta enabled the development of a model for CCA-addition. This corkscrew-model is compatible with all biochemical data and includes binding of an unstructured loop to the tRNA-substrate.     «

In the first part of this work, the crystal structures of proliferating nuclear antigen (Pfu-PCNA) and the catalytic domain of the DNA primase of Pyrococcus furiosus (Pfu-prim) were determined. Pfu-PCNA shows funktional and strukturall homology to processivity factors of DNA polymerases from bacteria, bacteriophages and eucaryotes. In the crystal it forms a crystallographic trimer and resembles the trimeric eucaryotic PCNA and the sliding-clamp of bacteriophages but not the dimeric beta-subunit...     »