Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP) ist einer der vielseitigsten enzymatischen Kofaktoren und spielt eine zentrale Rolle im Aminosäurestoffwechsel zahlreicher Organismen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Threonin Synthase (TS), einem PLP-abhängigen Enzym, das den letzten Schritt der Threoninbiosynthese von o-Homoserinphosphat zu Threonin katalysiert und nur in Bakterien, Pilzen sowie Pflanzen vorkommt. Aufgrund ihres Vorkommens ist die Threonin Synthase ein interessantes Target-Molekül zur Entwicklung neuer Fungi- und Herbizide. In dieser Arbeit konnte Threonin Synthase aus den Organismen Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana und Thermotoga maritima kloniert, gereinigt, charakterisiert sowie kristallisiert werden. Die Struktur des Hefe-Enzyms (TSH) wurde mit Hilfe eines MAD Experiments unter Verwendung von Selenomethionin bis 2,7 Å Auflösung mit einem R-Faktor von 21,7% gelöst. Die TSH weißt eine in drei Untereinheiten gegliederte, offene a/b-Struktur auf. Ein auffälliges Merkmal ist ein tiefer Kanal, der sich quer durch das gesamte Molekül erstreckt und in dessen Mitte der PLP-Kofaktor an der Kontaktfläche zwischen zwei Domänen gebunden ist. Erstmals konnte mit der vorgestellten Struktur ein monomeres PLP-Enzym charakterisiert werden und durch einen Strukturvergleich mit den bislang bekannten Faltungstyp II Molekülen Threonin Deaminase, O-Acetyl-Sulfhydrylase und der b-Einheit von Tryptophan Synthase diesem Faltungstyp eindeutig zugeordnet werden. Ein Vergleich von 30 TS Sequenzen zeigte, daß Threonin Synthase in zwei Unterfamilien, einer Pflanzenfamilie (enthält Pflanzen und Bakterien) und einer Pilzfamilie (enthält Pilze und Bakterien) vorliegt, zwischen denen nur insgesamt sechs Aminosäuren vollständig konserviert sind. Mit Hilfe der gelösten Struktur der TSH wurde der modellierte Enzym/Substrat Komplex energieminimiert. Basierend auf dem ES-Komplex konnte gezeigt werden, daß das PLP-bindende Lys für die Protonenübertragung während der Reaktion verantwortlich ist. Die Bindung des Substrats in einer Phosphatbindetasche wird über eine Vielzahl spezifischer Wasserstoffbrückenbindungen bewerkstelligt. Die Aminosäuren dieser Wasserstoffbrückenbindungen sind innerhalb der Pilz-Unterfamilie nahezu vollständig konserviert.     «

Pyridoxal-5'-Phosphat (PLP) ist einer der vielseitigsten enzymatischen Kofaktoren und spielt eine zentrale Rolle im Aminosäurestoffwechsel zahlreicher Organismen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Threonin Synthase (TS), einem PLP-abhängigen Enzym, das den letzten Schritt der Threoninbiosynthese von o-Homoserinphosphat zu Threonin katalysiert und nur in Bakterien, Pilzen sowie Pflanzen vorkommt. Aufgrund ihres Vorkommens ist die Threonin S...     »

Pyridoxal-5'-phosphate is one of the most versatile Cofactors in enzymes and plays a central role in the amino acid metabolism of many organisms. In this work the biochemical and structural characterisation of threonine synthase (TS), a PLP-dependent Enzyme that catalyse the last step in the biosynthesis of threonin from o-homoserinphosphate to threonin, was carried out. Threonine synthase occurs only in bacteria, fungi and plants and that's why it is an interesting target for new fungible and herbicide agents. In this work the threonine synthase from Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana and Thermotoga maritima was cloned, purified, characterised, and crystallised. The structure of the yeast enzyme (YTS) was solved in a MAD (multiple anomalous dispersion) experiment by using selenum methionine protein up to 2.7 Å resolution with an R-factor of 21.7%. YTS shows an open a/b-structure with three domains. A distinguishing mark is a deep channel covering the whole molecule. The PLP cofactor is situated in the middle of this channel on the contact surface of two domains. YTS is the first characterised monomeric PLP enzyme. By structure comparison with the three other known fold-type II enzymes threonine deaminase, O-Acetyl-sulfhydylase and the b-subunit of tryptophan synthase it was possible to group threonine synthase unequivocal to the fold-type II. A comparison between 30 TS sequences shows a split into two subfamilies, a plant family (comprising plants and bacteria) and a fungi family (comprising fungi and bacteria). Only six amino acids are conserved in both families. Based on the solved structure the modelled enzyme/substrate-complex was energy minimised. Accordingly to the ES-complex the PLP-binding Lys is responsible for the proton transfer during the reaction. The binding of the substrate in a phosphate-binding pocket is carried out by several specific hydrogen bonds. The amino acids forming this hydrogen bonds are almost completely conserved in the fungi sub-family.     «

Pyridoxal-5'-phosphate is one of the most versatile Cofactors in enzymes and plays a central role in the amino acid metabolism of many organisms. In this work the biochemical and structural characterisation of threonine synthase (TS), a PLP-dependent Enzyme that catalyse the last step in the biosynthesis of threonin from o-homoserinphosphate to threonin, was carried out. Threonine synthase occurs only in bacteria, fungi and plants and that's why it is an interesting target for new fungible and h...     »