The psychrotolerant Y. enterocolitica is an emerging foodborne pathogen and has the ability to proliferate at low temperatures (down to –5°C), while E. coli has a minimum of temperature growth at 8°C. This characteristic of Y. enterocolitica is important for bacterial growth in contaminated refrigerated food, water and blood supply. Answering the question, how growth at low temperature could be inhibited, requires fundamental knowledge about specific metabolic factors which enable this organism to accommodate rapidly and to multiply at low temperatures. Temperature downshift from 30°C to 10°C leads to the induction of mRNA transcription of the cold-shock protein tandem gene cspA1/A2 (Neuhaus, Francis et al. 1999). A number of cspA1/A2 specific degradation intermediates accumulate at the end of the cold acclimation period. Primer extension assays demonstrated that these degradation products had 5´ terminus at a common core sequence 5´-AGUAAA-3´ (Neuhaus 2000). In this study we wanted to test if this sequence was responsible for cleavage and degradation of cspA1/A2 mRNA. The AGUAAA core sequence was found to be present in the csp genes of many Gram negative and Gram positive bacteria. Cleavage was also obtained in the mRNA transcribed from the E. coli cspB gene, which contains two of these core sequences. After inserting this motif into a plasmid-bound lacZ gene in Y. enterocolitica, the mRNA of this construct was also cleaved within the motif. Moreover, changing the motif from AGUAAA to AGUCCC dramatically reduced cleavage, but did not completely abolish it. RNase E dependent cleavage was shown for the construct with AGUAAA motif according to the in vivo analysis of E. coli mutants. In vitro cleavage of total mRNA and synthetic oligoribonucleotides carrying this motif by the catalytic domain of RNase E and RNase G provided evidence that the AGUAAA sequence played a role in allowing cspA1/A2 transcripts to be efficiently cleaved by RNase E and not by RNase G. Since an excess of cspA mRNA block ribosomes, efficient removal of this mRNA species from the cell is essential for later stages of cold adaptation. Further it was interesting to analyze other factors that may also contribute to the mRNA degradation at low temperatures. During cold-shock conditions PNPase has been considered to play an important role in selective degradation of csp mRNAs and it was shown that pnp gene is also cold-shock inducible (Goverde, Huis in't Veld et al. 1998). We have characterized nlp1 and deaD genes downstream from pnp gene in Y. enterocolitica and have shown that they are induced in response to temperature downshift during exponential growth phase. By Northern hybridization it was shown that pnp, nlp1 and deaD are part of a polycistronic operon and they are cotranscribed as cold temperature induced mRNA. Stabilization of mRNA is involved in the synthesis of DeaD RNA helicase, due to the accumulation of polycistronic transcript during a cold shock. Two regions in front of pnp gene and in front of deaD gene were analyzed for promoter activity by primer extension and by transcriptional egfp fusion constructs. In addition to the pnp promoter, primer extension experiments revealed the existence of two further transcription start sites upstream of the deaD; PdeaD1 and PdeaD2. Analysis of transcriptional egfp fusions showed that transcription from the Ppnp promoter was constitutive at 30°C and 10°C and transcription from the two deaD promoters was enhanced 4 hours after cold-shock with a further increase of the PdeaD2 transcriptional activity up to 20 hours. At 30°C activity of the Ppnp and PdeaD2 promoters was lower than the activity of the PlacZ promoter which has been used as a control. After cold-shock EGFP activity from the Ppnp and PdeaD2 promoters was detected after 20h incubation at 10°C, while efficiency of the PlacZ promoter was strongly reduced. Results from this work clearly demonstrate that regulation of deaD gene expression at low temperature is under transcriptional and posttranscriptional control, and that the identified cold-shock elements contribute to the differential expression of PNPase, Nlp1 and DEAD RNA helicase of Y. enterocolitica.     «

The psychrotolerant Y. enterocolitica is an emerging foodborne pathogen and has the ability to proliferate at low temperatures (down to –5°C), while E. coli has a minimum of temperature growth at 8°C. This characteristic of Y. enterocolitica is important for bacterial growth in contaminated refrigerated food, water and blood supply. Answering the question, how growth at low temperature could be inhibited, requires fundamental knowledge about specific metabolic factors which enable this organism...     »

Das psychrotolerante Bakterium Yersinia enterocolitica ist ein Lebensmittelkeim, der bei niedrigen Temperaturen bis –5°C zum Wachstum befähigt ist, während E. coli bereits bei 8°C ein Wachstumsminimum aufweist. Dieses Charakteristikum von Y. enterocolitica ist insofern von großer Bedeutung, als dieser pathogene Keim sich dadurch auch in gekühlten Nahrungsmitteln, in Trinkwasser oder in Blutkonserven vermehren kann. Um die Frage zu beantworten, wie sich das Wachstum von Yersinien bei niedrigen Temperaturen möglicherweise hemmen lässt, ist eine genaue Kenntnis der intrazellulären Vorgänge bei der Kälteadaptation erforderlich. Nach einer plötzlichen Temperaturerniedrigung („Kälteschock“) von 30°C auf 10°C wird in Y. enterocolitica effizient ein bicistronisches Gentandem mit den Hauptkälteschockproteinen CspA1 und CspA2 induziert. Zur schnellen Anpassung an diese neuen Umweltbedingungen gehört nun nicht nur die Induktion neuer mRNAs für Stressproteine, sondern auch deren Regulation auf posttranskriptioneller Ebene durch mRNA-Abbau. Nach erfolgter Anpassung an den Kälteschock mit Hilfe der Kälteschockproteine CspA1/A2 muss zwischenzeitlich in großen Mengen synthetisierte mRNA wieder abgebaut werden, da sonst die Ribosomen von diesem Überschuss an mRNA blockiert werden. Im Anschluss an eine Phase der Kälteanpassung akkumulieren eine Reihe von cspA1/cspA2-spezifischen mRNA-Intermediaten, denen die Sequenz AGUAAA am 5´-Ende gemeinsam ist. Diese Konsensussequenz findet sich in den csp-Genen vieler Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien. Folgerichtig wurden auch in E. coli entsprechende Spaltprodukte der mRNA des cspB-Genes beobachtet, die zwei AGUAAA-Sequenzen aufweist. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der AGUAAA-Sequenz bei der Kälteadaptation von Y. enterocolitica untersucht. Dazu wurde die Konsensussequenz zunächst in ein lacZ-Gen auf einem pBlueScript-Vektor kloniert. Wie erwartet erfolgte ein Abbau dieser chimären mRNA bevorzugt an der eingefügten Schnittstelle AGUAAA. Eine leicht veränderte Schnittsequenz (AGUCCC) zeigte hingegen einen deutlichen Abfall der Schnittintensität. Der Nachweis, dass dieses Spaltung RNase E-abhängig ist, wurde für Konstrukte mit AGUAAA-Motiv durch entsprechende in vivo-Analyse in E. coli-Mutanten gezeigt. In vitro Spaltungsexperimente von Gesamt-RNA und synthetischen Oligoribonucleotiden, die dieses Motiv tragen, in Gegenwart der RNase E und der RNase G lieferte den Beweis, dass der Abbau von cspA1/A2-mRNA durch die RNase E und nicht durch die RNase G erfolgt, und dass die katalytische Domäne der RNase E die AGUAAA Sequenz erkennt. Weiterhin wurden zusätzliche Faktoren analysiert, die ebenfalls zum mRNA-Abbau bei niedrigen Temperaturen beitragen. Während der Kälteschock-Phase wird die Induktion der PNPase beobachtet, die eine wichtige Rolle in der mRNA-Degradation von cspA spielt (Goverde, Huis in't Veld et al. 1998). In dieser Arbeit wurde ein 6253 bp langes DNA-Fragment aus Y. enterocolitica sequenziert, das neben dem pnp-Gen auch das nlp1- und deaD-Gen trägt. Hier wurde gezeigt, dass diese Gene nach einem Kälteschock während der exponentiellen Wachstumsphase induziert werden. Dabei ergab sich, dass die Stabilisierung der nach einem Kälteschock akkumulierten mRNA bei der Synthese der DeaD RNA-Helicase wichtig ist. Durch Northern-Hybridisierung wurde für die Gene pnp, nlp1 und deaD nachgewiesen, dass sie Teil eines polycistronisches, kälteinduzierten Operons sind. Zwei Regionen vor dem pnp-Gen bzw. dem deaD-Gen wurden mittels Primer- Extension und transkriptioneller egfp-Fusionen analysiert. Die Untersuchung dieser 5‘-Regionen bestätigte bzw. deckte den Transkriptionsstart des pnp-bzw. deaD-Genes auf. Darüberhinaus konnte eine Reihe von DNA-und RNA-Elementen, die charakteristisch sind für kälteinduzierte Gene, gefunden werden; dazu zählen eine 5´-UTR-Region, eine „downstream-box“ sowie eine „cold-shock-box“. Die Analyse der transkriptionellen egfp-Fusion zeigte, dass das deaD-Gen vom pnp-Promotor und von seinem eigenen Promotor während der Kälteschock synthetisiert wird. Die Aktivität des pnp- und des deaD2-Promotors war bei 30°C niedriger als die Aktivität des lacZ-Promotor, der als Kontrolle diente. Die Aktivität des pnp Promotors bei 30°C und 10°C bleibt konstant. Der deaD2-Promotor offenbar bei 10°C stärker induziert wird als bei 30°C, während die Aktivität des lacZ-Promotor bei 10°C stark reduziert wurde. Die hier vorgestellten Resultate zeigen, dass die Regulation der deaD Genexpression bei niedrigen Temperaturen unter transkriptioneller und posttranskriptioneller Kontrolle steht.     «

Das psychrotolerante Bakterium Yersinia enterocolitica ist ein Lebensmittelkeim, der bei niedrigen Temperaturen bis –5°C zum Wachstum befähigt ist, während E. coli bereits bei 8°C ein Wachstumsminimum aufweist. Dieses Charakteristikum von Y. enterocolitica ist insofern von großer Bedeutung, als dieser pathogene Keim sich dadurch auch in gekühlten Nahrungsmitteln, in Trinkwasser oder in Blutkonserven vermehren kann. Um die Frage zu beantworten, wie sich das Wachstum von Yersinien bei niedrigen Te...     »