The yeast ‘cell division cycle protein 48’ (Cdc48p) and its highly conserved human orthologue ‘valosin-containing protein’ (VCP) are ubiquitin-controlled AAA-ATPases (ATPases associated with various cellular activities). Cdc48p/VCP is involved in different cellular processes, such as ER-associated protein degradation (ERAD), membrane fusion and cell cycle control. VCP has been proposed as a sensor for misfolded proteins associated with neurodegenerative disorders, such as Machado-Joseph, Parkinson and Alzheimer disease. Upon mutation human VCP is causative for ‘inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia’ (IBMPFD), a hereditary disease characterized by protein deposits in either myofibrils or brain. Mutation of Cdc48p/VCP leads to apoptotic cell death in mammalian cells, in zebrafish, Caenorhabditis elegans and in the unicellular organism Saccharomyces cerevisiae. However, the cellular mechanisms of apoptotic cell death upon mutation of Cdc48p/VCP and the pathophysiological role of this protein in the progression of human degenerative disorders have remained unresolved. In this study, a systematic proteome analysis of the apoptotic cdc48S565G mutant yeast strain was performed, in order to reveal apoptosis-associated proteome alterations that may help to elucidate cellular mechanisms underlying Cdc48p/VCP-mediated cell death. Differential two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of the apoptotic cdc48S565G mutant and the CDC48 wild-type yeast strain resulted in significant protein spot alterations in mitochondrial extracts. Both altered amounts of mitochondrial proteins and accumulation of Cdc48p-S565G itself and other proteins associated with the NE-ER (nuclear envelope-endoplasmic reticulum) were observed in mitochondrial extracts of the cdc48S565G strain. Starting from these results, mitochondria were demonstrated to play a pivotal role during apoptotic cell death in the cdc48S565G strain: Depletion of mitochondrial proteins essential for mitochondrial function was found to be associated with mitochondrial swelling, respiratory deficiency of yeast cells, release of cytochrome c into the cytosol, and accumulation of reactive oxygen species (ROS) produced by mitochondria. Generating yeast strains completely lacking functional mitochondria (ρ0 strains) resulted in the assimilation of the viabilities of wild-type and cdc48S565G cells under apoptotic growth conditions, confirming a deleterious role of mitochondria during apoptotic cell death. The increased co-purification of Cdc48p-S565G and other NE-ER-associated proteins with mitochondria as observed by 2-DE was demonstrated to be due to an augmented co-migration of microsomes with mitochondria in mitochondrial extracts. Ultrastructural analysis by electron microscopy revealed augmented proximity of NE-ER membranes and mitochondria in cdc48S565G cells, indicating an increased association of NE-ER and mitochondria in apoptotic cdc48S565G cells. Increased amounts of polyubiquitinated proteins in total cell extracts and microsomal extracts point to a dysfunction of Cdc48p-S565G in ERAD. Polyubiquitinated proteins were found to be strongly associated with a subset of mitochondria, whereas the majority of mitochondria were not affected. The polyubiquitinated mitochondrial fraction comprised markedly increased amounts of Cdc48p-S5656, ER stress marker Kar2p and microsomes. The observed increased association of NE-ER and mitochondria in cdc48S565G cells demonstrates for the first time that cellular stress localized at the NE-ER due to mutation in CDC48 and dysfunction of ERAD is transmitted to mitochondria. This may result in mitochondrial damage that initiates mitochondria to produce ROS and thus triggering apoptotic cell death. In order to verify if the results obtained in the cdc48S565G yeast strain are relevant for events in VCP-mediated cell death, a mammalian cell culture system expressing human VCP variants was established. Decreased cell viability, increased apoptotic cell death and accumulation of polyubiquitinated proteins was observed in cells expressing the dominant ATPase-deficient human VCP variant VCP-K524A and the VCP variant VCP-S555G, the homologous variant to yeast Cdc48p-S565G. Coexpression of VCP and of the ERAD substrate rhodopsin resulted in the accumulation of aggregated rhodopsin in the case of VCP-K524A and VCP-S555G, showing the defect of these variants in ERAD. Since these are highly similar features as observed in the cdc48S565G yeast strain, these data obtained in mammalian cell culture validate the use of the yeast model system. In contrast, in mammalian cells expression of the IBMPFD-causing VCP variant VCP-R155H did not affect cell viability. However, VCP-R155H demonstrated deficiency in ERAD but much less severe comparerd to VCP-K524A and VCP-S555G. Thus, ERAD deficiency upon Cdc48p/VCP mutation is per se not sufficient to trigger cell death. However, the ERAD deficiency of VCP-R155H might become deleterious and may result in the induction of apoptotic cell death upon enrichment of proteins during ageing. Based on the results obtained in the cdc48S565G yeast strain, a crucial mitochondrial involvement during apoptosis in cells with dysfunctional VCP and ERAD should be evaluated in the future.     «

The yeast ‘cell division cycle protein 48’ (Cdc48p) and its highly conserved human orthologue ‘valosin-containing protein’ (VCP) are ubiquitin-controlled AAA-ATPases (ATPases associated with various cellular activities). Cdc48p/VCP is involved in different cellular processes, such as ER-associated protein degradation (ERAD), membrane fusion and cell cycle control. VCP has been proposed as a sensor for misfolded proteins associated with neurodegenerative disorders, such as Machado-Joseph, Parkins...     »

Das Hefe-Zellzyklusprotein 48 (Cdc48p) und dessen hochkonserviertes menschliches Ortholog‚ Valosin-enthaltendes Protein’ (VCP), sind Ubiquitin-kontrollierte AAA-ATPasen (ATPasen assoziiert mit verschiedenen zellulären Aktivitäten). Cdc48p/VCP ist in verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z.B. im ER-assoziierten Proteinabbau (ERAD), bei Membranfusionsprozessen und bei der Zellzykluskontrolle. VCP wurde als Sensor für falschgefaltete Proteine vorgeschlagen, die mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie z.B. Machado-Joseph-, Parkinson- und Alzheimer-Erkrankung, in Zusammenhang gebracht werden. Nach Mutation ist VCP ursächlich für die Erbkrankheit IBMPFD, die durch das Auftreten von Proteinablagerungen in Muskelgewebe oder Gehirn charakterisiert ist und zu Muskelschwäche, zur Paget’schen Knochenerkrankung und zu frontotemporaler Demenz führen kann. Mutationen von Cdc48p/VCP führen in Säugerzellen, in Zebrafischen, in Caenorhabditis elegans und im Einzeller Saccharomyces cerevisiae zu apoptotischem Zelltod. Die molekularen Mechanismen des Zelltods ausgelöst durch Mutationen in Cdc48p/VCP und die pathophysiologische Rolle dieses Proteines im Verlauf menschlicher Erkrankungen blieben jedoch ungeklärt. In dieser Studie wurde eine systematische Proteomanalyse des apoptotischen Hefestamms cdc48S565G durchgeführt, um apoptoseassoziierte proteomische Veränderungen zu identifizieren, die helfen könnten, den Mechanismus des Cdc48p/VCP-vermittelten Zelltodes aufzulösen. Vergleichende zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2-DE) des apoptotischen Stammes cdc48S565G und des Wildtyp-Stammes CDC48 ergab signifikante Proteinveränderungen in mitochondrialen Extrakten. Sowohl veränderte Mengen an mitochondrialen Proteinen als auch eine Anreicherung von Cdc48p-S565G und anderen Proteinen, die mit dem NE-ER (Kernhülle und endoplasmatisches Retikulum) assoziiert sind, konnten in mitochondrialen Extrakten des cdc48S565G-Stamms beobachtet werden. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde eine entscheidende Rolle von Mitochondrien im apoptotischen Zelltod im cdc48S565G-Stamm gezeigt: Eine Abreicherung mitochondrialer Proteine, die essenziell für die mitochondriale Funktionstüchtigkeit sind, konnte genauso beobachtet werden wie ein Anschwellen der Mitochondrien, die Unfähigkeit von cdc48S565G-Zellen zur Atmung, die Freigabe von Cytochrom c in das Zytosol und die Anreicherung von in Mitochondrien hergestellten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Die Herstellung von Hefestämmen, die frei von funktionstüchtigen Mitochondrien sind (ρ°-Stämme) ergab eine Angleichung der Überlebensfähigkeit von Wildtyp- und cdc48S565G-Zellen unter apoptotischen Wachstumsbedingungen, was die schädliche Rolle von Mitochondrien während der Apoptose bestätigt. Die bei 2-DE-Analysen beobachtete verstärkte Aufreinigung von Cdc48p-S565G und anderen NE-ER-assoziierten Proteinen mit Mitochondrien konnte auf eine verstärkte Komigration von Mikrosomen mit Mitochondrien zurückgeführt werden. Die durch Elektronenmikroskopie beobachtete größere Nähe von NE-ER-Membranen und Mitochondrien in cdc48S565G-Zellen zeigt deshalb eine zunehmende Assoziation von NE-ER und Mitochondrien. Größere Mengen an polyubiquitinylierten Proteinen in Gesamtzell- und mikrosomalen Extrakten weisen auf eine Dysfunktion von Cdc48p-S565G im ERAD. Polyubiquitinylierte Proteine wurden stark assoziiert in einer Untergruppe von Mitochondrien gefunden, in der deutlich erhöhte Mengen an Cdc48p-S565G, am ER-Stressmarker Kar2p und an Mikrosomen gefunden wurden. Die beobachtete verstärkte Assoziation von NE-ER und Mitochondrien in cdc48S565G-Zellen zeigt zum ersten Mal, dass am NE-ER lokalisierter zellulärer Stress, aufgrund der Mutation in CDC48 und der Dysfunktion von ERAD, auf Mitochondrien übertragen werden könnte. Die daraus folgende Schädigung der Mitochondrien könnte zur Herstellung von ROS und zur Auslösung von apoptotischem Zelltod führen. Um zu überprüfen, ob die Ergebnisse, die mit Hilfe des cdc48S565G-Stammes gewonnen wurden, übertragbar sind auf die Vorgänge beim VCP-vermittelten Zelltod, wurden Säugerzellkulturen analysiert, die menschliche VCP-Varianten exprimierten. Expression der dominanten ATPase-defizienten Variante VCP-K524A und der zur Hefemutante Cdc48p-S565G homologen Variante VCP-S555G führte zu einer abnehmenden Zellviabilität, zunehmendem Zelltod und zu einer zellulären Anreicherung an polyubiquitinylierten Proteinen. Weiterhin zeigen Koexpressionsstudien von VCP und dem ERAD-Substrat Rhodopsin eine Anreicherung von Rhodopsinaggregaten bei Koexpression mit VCP-K524A und VCP-S555G, was auf einen Defekt dieser Varianten im ERAD hin deutet. Diese zum cdc48S565G-Stamm sehr ähnlichen Ergebnisse unterstützen den Nutzen des Hefemodells. Die Expression der IBMPFD-auslösenden Variante VCP-R155H hat keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der Zellkultur. Allerdings zeigt diese Variante eine, wenn auch zu VCP-K524A und VCP-S555G deutlich weniger ausgeprägte, Defizienz im ERAD. Demnach ist ERAD-Defizienz allein nicht ausreichend zur Einleitung des Zelltodes. Die ERAD-Defizienz von VCP-R155H könnte jedoch schädlich werden und zu apoptotischem Zelltod führen, wenn sich falsch gefaltete Proteine in Alterungsprozessen anreichern. In Zukunft sollte nun anhand der Ergebnisse des cdc48S565G-Hefemodells eine kritische mitochondriale Beteiligung an der Apoptose von Zellen mit dysfunktionalem VCP bzw. ERAD untersucht werden.     «

Das Hefe-Zellzyklusprotein 48 (Cdc48p) und dessen hochkonserviertes menschliches Ortholog‚ Valosin-enthaltendes Protein’ (VCP), sind Ubiquitin-kontrollierte AAA-ATPasen (ATPasen assoziiert mit verschiedenen zellulären Aktivitäten). Cdc48p/VCP ist in verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z.B. im ER-assoziierten Proteinabbau (ERAD), bei Membranfusionsprozessen und bei der Zellzykluskontrolle. VCP wurde als Sensor für falschgefaltete Proteine vorgeschlagen, die mit neurodegenerativen Er...     »