In der heutigen „Post-Genom-Ära“ steht die systematische Funktionsanalyse der Gene mit Hilfe der Proteomanalyse im Mittelpunkt der biomedizinischen Forschung. Man erhofft sich, auf diese Weise tiefere Einblicke in die Funktion biologischer Prozesse zu gewinnen. Allerdings lassen sich diese Erwartungen nur erfüllen, wenn es gelingt, die zur Verfügung stehenden Analyseverfahren so weit zu verbessern, dass sie Trennung, Nachweis und quantitative Bestimmung möglichst aller in einer Zelle vorhandenen Proteine erlauben. Ziel der Arbeit war die Weiterentwicklung von Methoden zur Trennung und Identifizierung bis dato stark unterrepräsentierter Proteine (gering-exprimierte, sehr hydrophobe, sehr stark basische), mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese (2DE) mit immobilisierten pH-Gradienten (IPG). Als Beispielorganismus diente dabei, der großtechnisch zur Produktion von Aminosäuren eingesetzte Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum.
Erstmalig konnte auf 2D-Gelen eine Reihe extrem basischer C. glutamicum Proteine (z.B. rpsD, rplD, rpsG) durch Einsatz und Optimierung der IEF mit basischen IPGs bis pH 12 aufgetrennt und identifiziert werden. Desweiteren gelang es, putative gering-exprimierte C. glutamicum Proteine (z.B. cg0439, cg1903, cg0764) durch Kombination neu entwickelter IPGs mit erhöhtem Auflösungsvermögen und einem Proteinvorfraktionierungsverfahren auf Basis der Sephadex-IEF zu detektieren und zu identifizieren. Anschließend wurden diese optimierten Analysetechniken in Kombination mit der 2D-DIGE erfolgreich zur vergleichenden Proteomanalyse des Wildtypes und eines Produktionsstammes von C. glutamicum sowie zum Vergleich der Proteinexpressionsmuster nach Anzucht auf unterschiedlichen Nährmedien und Kohlenstoff-Quellen eingesetzt. Durch Vergleich der Proteinexpressionsmuster von C. glutamicum nach Anzucht auf Glucose- bzw. Acetatmedium konnten sowohl bisherige in der Literatur publizierte Ergebnisse auf der Ebene des Transkriptoms vollauf bestätigt (z.B. icl, ms, pyc), darüber hinaus einige bislang nur postulierte, jedoch noch nicht nachgewiesene co-regulierte Gene (z.B. glpX, gapX, actA, mqo) identifiziert werden.
Übersetzte Kurzfassung:
In the “post-genomic era” the systematic analysis of gene function by means of proteome analysis has raised great expectations in biological and medical research to gain new insights into the function and control of biological processes and disease. Yet these expectations will be difficult to accomplish unless today’s proteomic technologies are improved in many ways to facilitate the separation, detection und quantitation of all proteins expressed in the cell. The aim of this work was the development of advanced methods to facilitate the separation and identification of proteins that are “critical” to analyse (i.e., low abundant, very hydrophobic, and/or highly basic proteins), by two-dimensional electrophoresis (2DE) with immobilized pH gradients (IPG), exemplified by proteome analysis of the biotechnologically important amino acid-overproducing microorganism Corynebacterium glutamicum.
By developing and/or improving alkaline IPG strips up to pH 12, the separation and identification of extremely basic C. glutamicum proteins (e.g., rpsD, rplD, rpsG) on 2DE-Gels was enabled for the first time. Moreover, by combining customised IPG strips with increased resolving power through a protein prefractionation method based on Sephadex-IEF, a number of low abundance C. glutamicum proteins could be detected and identified (e.g. cg0439, cg1903, cg0764). Subsequently, these optimized analysis techniques were successfully applied in combination with 2D-DIGE, to perform quantitative proteome analyses of the wildtype versus the production strain of C. glutamicum, as well as for the comparison of protein expression profiles after cultivating C. glutamicum cells in different growth media and on different carbon sources. Comparison of the differential protein expression profiles of C. glutamicum cells grown on glucose- or acetate-medium fully confirmed results previously reported at the transcriptome level (e.g. icl, ms, pyc). In addition the overexpression of several postulated, but not yet identified, co-regulated genes (e.g. glpX, gapX, actA, mqo) was verified.
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