Primary bovine mammary epithelial cells (pbMEC) are increasingly used as primary cell culture model to investigate the molecular mechanisms of the innate immune response in the bovine mammary gland. High producing dairy cows are often challenged with mastitis pathogens like Staphylococcus aureus or Escherichia coli. As pbMEC are lining the alveoli of the bovine udder, they contribute to the blood-mammary gland barrier and are already known to be able to recognize pathogens and furthermore, induce specific signaling pathways that result in the production and secretion of chemotactic molecules. However, in order to elucidate molecular mechanisms that are responsible for the functionality of the innate immune response cascade, it is important to employ advanced cell culture models that better guarantee the transferability of in vitro data. Therefore, our aim was to establish an advanced, more in vivo-like cell culture model that enables a more native behavior of pbMEC in vitro. pbMEC extracted from milk of healthy Brown Swiss cows were non-invasively extracted and used for the generation of a functional 3D cell culture model. The extracellular matrix was mimicked using the extracellular matrix-like scaffold Matrigel® and the cell culture medium was further supplemented with lactogenic hormones, like prolactin and hydrocortisone, and the essential amino acid L-lysine. The 3D cell culture model was further used to conduct two infection studies with pbMEC obtained from Brown Swiss cows. The aim of the first study was to elucidate a set of special molecular biomarkers that play a key role in the promotion of innate immunity against gram-positive bacteria. Furthermore, those molecular biomarkers should be used to distinguish between high and low responder dairy cows. The term high and low responder cow, hereby refers to the ability of the animal to produce and secrete high specific immunoglobulin concentrations into the milk. The human pathogen Clostridium difficile is of great interest in case of the production of immune milk that can be applied to protect patients from the recurrent Clostridium difficile associated diarrhea. Therefore, this gram-positive pathogen, was used for the immune treatment in vitro and for the preceding immunization of the cows. Within the second immune study, the effect of the metabolite beta-hydroxybutyrate (BHBA) on the innate immune response of pbMEC challenged with the gram-negative mastitis pathogen Escherichia coli was investigated. Elevated levels of BHBA normally accumulate in the early phase of lactation, in the case of negative energy balance, and often result in the metabolic disorder ketosis. We successfully established a 3D cell culture of pbMEC isolated from fresh milk and showed that pbMEC cultured in 3D cell culture showed a polarized phenotype and were hence able to form alveolar-like structures in vitro. Furthermore, the cultivation of pbMEC resulted in an enhanced production and secretion of milk and whey proteins. Changes in the gene expression pattern of genes coding for milk proteins and for components of the JAK-STAT and mTOR pathway, were compared between pbMEC cultured in 3D and 2D cell culture. The enhanced functionality of the cells cultured in 3D cell culture was verified by RT-qPCR and LC-MS/MS measurements. Furthermore, within the first infection study, the gene expression profiles of 61 selected immune relevant genes were compared between the high and low responder animals using a RT-qPCR approach (BioMarkTM HD 96x96, Fluidigm). Results of this study indicated, that especially the pro-inflammatory cytokines are suitable to serve as molecular biomarkers to select for high responder animals. In the second infection study we were able to determine a declined innate immune response when pbMEC were co-stimulated with Escherichia coli and BHBA in vitro. The immunosuppressive effect of BHBA on the innate immune response of pbMEC was hereby evaluated using RT-qPCR and ELISA measurements. Based on these results we concluded that a functional 3D cell culture model of pbMEC was successfully established, which can be further used for immunological and metabolic studies. We are convinced that this 3D cell culture model can be used in future studies to obtain more faithful, valid and representative data, as this cell culture approach represents a more in-vivo like model of the functional bovine mammary gland.      «

Primary bovine mammary epithelial cells (pbMEC) are increasingly used as primary cell culture model to investigate the molecular mechanisms of the innate immune response in the bovine mammary gland. High producing dairy cows are often challenged with mastitis pathogens like Staphylococcus aureus or Escherichia coli. As pbMEC are lining the alveoli of the bovine udder, they contribute to the blood-mammary gland barrier and are already known to be able to recognize pathogens and furthermore, induc...     »

Zur Erforschung der molekularen Mechanismen der innaten Immunantwort im bovinen Euter werden vor allem primäre bovine Euterepithelzellen (pbMEC) verwendet. Da pbMEC die Alveolen des bovinen Euters auskleiden, stellen sie die erste zelluläre Abwehr gegen mögliche Pathogene dar und bilden somit die Blut-Euter-Schranke. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass pbMEC Pathogene erkennen und spezifische Signaltransduktionswege induzieren können, die zur Produktion und Sekretion von chemotaktischen Molekülen führen. Es ist allerdings von großer Bedeutung abgewandelte Zellkulturmodelle, für die Erforschung zugrundeliegender molekular-physiologischer Mechanismen der innaten Immunantwort, zu etablieren. Dies könnte die Übertragbarkeit der Daten, die in einem in vitro Modell generiert wurden, erleichtern. Unser Ziel war es ein funktionales 3D Zellkulturmodell der pbMEC zu generieren, welches versucht die Umgebung der pbMEC möglichst realitätsgetreu nachzuahmen. Hierfür wurden pbMEC aus der Milch von Brown Swiss Kühen isoliert und auf dem, die extrazelluläre Matrix nachahmendem Gerüst, Matrigel®, kultiviert. Den unterschiedlichen Zellkulturmedien-Kompositionen, wurden zudem noch die laktogenen Hormone Prolaktin und Hydrokortison und die essentielle Aminosäure L-Lysin zugesetzt. Basierend auf diesem funktionalen 3D Zellkultur Ansatz wurden zwei Infektionsstudien an isolierten pbMEC durchgeführt. Im Rahmen der ersten Studie sollten potentielle molekulare Biomarker gefunden werden, die eine Schlüsselrolle in der innaten Immunantwort gegen gram-positive Bakterien, einnehmen. Zudem sollten die molekularen Biomarker dazu beitragen, laktierende Kühe in „High Responder“ und „Low Responder“ zu unterteilen. Die Begriffe High und Low Responder definieren sich hierbei durch die Menge an spezifischem Immunglobulin A, das die Kuh durch eine vorangegangene Immunisierung produzieren und in die Milch abgeben kann. Im Rahmen dieser ersten Immunstudie wurde der gram-positive Erreger Clostridium difficile sowohl für die Immunisierung der Tiere als auch für die in vitro Immunstudien verwendet. Der gram-positive Erreger ist von großem Interesse für die Produktion von Immun-Milch, die zur Prävention von Clostridium difficile assoziierten Durchfallerkrankungen eingesetzt werden soll. Die zweite Studie befasste sich mit den Auswirkungen des Ketonkörpers Beta-Hydroxybutyrat (BHBA) auf die innate Immunantwort der pbMEC, welche mit dem gram-negativen Mastitis-Erreger Escherichia coli induziert wurden. Erhöhte BHBA Konzentrationen akkumulieren vor allem in der frühen Phase der Laktation und führen im Falle einer negativen Energiebilanz zur Entstehung der Stoffwechselerkrankung Ketose Wir konnten erfolgreich ein 3D Zellkulturmodell von, aus frischer Milch isolierten, pbMEC etablieren und zeigen, dass pbMEC, die in 3D Zellkultur kultiviert wurden, einen polarisierten Phänotyp aufwiesen und dadurch in der Lage waren Alveolen-artige Strukturen in vitro zu bilden. Zudem resultierte die Kultivierung der pbMEC in 3D Zellkultur in einer verstärkten Produktion und Sekretion von Milch- und Molkenproteinen. Die Änderungen im Genexpressionsprofil von Genen, die für Milchproteine, aber auch für Komponenten des JAK-STAT und mTOR Signaltransduktionswegs kodierten, wurden zwischen pbMEC, die in 3D und 2D Zellkultur kultiviert wurden, verglichen. Die verbesserte Funktionalität der pbMEC in 3D Zellkultur, konnte durch RT-qPCR Experimente und LC-MS/MS Messungen nachgewiesen werden. In der ersten immunologischen Studie, die mit Hilfe des 3D Zellkulturmodells durchgeführt wurde, konnten durch ein RT-qPCR Verfahren (BioMarkTM HD 96x96, Fluidigm), 61 Expressionsprofile von ausgewählten Immungenen zwischen den High und Low Responder Tieren abgeglichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich vor allem die pro-inflammatorischen Zytokine als potentielle molekulare Biomarker eignen. Im Rahmen der zweiten immunologischen Studie konnte mit Hilfe von RT-qPCR und ELISA Messungen ein immunsuppresiver Effekt durch die Co-Stimulation der pbMEC mit Escherichia coli und BHBA gezeigt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte die erfolgreiche Entwicklung eines funktionalen 3D Zellkulturmodells der pbMEC beschrieben werden. Dieses 3D Zellkulturmodell, das die in vivo Situation der pbMEC besser repräsentiert, erscheint sehr vielversprechend für die zukünftige Generierung von vertrauensvollen und in vivo nahen Forschungsergebnissen.      «

Zur Erforschung der molekularen Mechanismen der innaten Immunantwort im bovinen Euter werden vor allem primäre bovine Euterepithelzellen (pbMEC) verwendet. Da pbMEC die Alveolen des bovinen Euters auskleiden, stellen sie die erste zelluläre Abwehr gegen mögliche Pathogene dar und bilden somit die Blut-Euter-Schranke. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass pbMEC Pathogene erkennen und spezifische Signaltransduktionswege induzieren können, die zur Produktion und Sekretion von chemotaktisc...     »