Der Entwicklung von Fungiziden mit neuen Ansatzstellen und Wirkmechanismen hat aufgrund stetiger Resistenzbildung gegen landwirtschaftlich genutzte Fungizide eine herausragende Bedeutung für die Sicherung einer auch zukünftig hochproduktiven und -qualitativen Pflanzenproduktion. Insbesondere durch Fungizidmaßnahmen während früher Infektionsstadien kann ein nachhaltiger Schutz der Nutzpflanze erreicht werden. Unter Verwendung der cDNA-AFLP-Methode sowie durch Einsatz der SSH Technik konnten insgesamt 50 bzw. 47 singuläre differentiell exprimierte cDNA-Sequenzen aus keimenden Sporen von Phytophthora infestans bzw. Pyrenophora teres identifiziert werden. Zur exakten Quantifizierung der Expression wurden 14 dieser Transkripte zusätzlich über real time RT PCR analysiert. Die Normalisierung von differentiell exprimierten Genen erfolgte mit der 18S rRNA, die sich als geeigneter endogener Standard in quantitativen Expressionsstudien mittels realtime RT PCR während der Sporenkeimung von phytopathogenen Pilzen erwiesen hat. Alle Transkripte zeigten während der 24-stündigen in vitro Keimung einen im Vergleich zur ungekeimten Spore signifikanten Anstieg ihrer relativen Expressionsraten, was die Wirksamkeit der angewandten differentiellen Techniken bestätigt. Die maximalen Expressionsraten variierten zwischen dem 1,5- und 29,0-fachen der Ausgangsexpression. In vegetativem Mycel wurden im Vergleich zu den Expressionsmaxima während der Sporenkeimung deutlich niedrigere Expressionsniveaus festgestellt. Nach einem Datenbankabgleich der 97 differentiell exprimierten Gene konnte für 35 Sequenzen deren mutmaßliche Funktion aufgrund signifikanter Homologien zu Datenbankeinträgen vorhergesagt werden. Darunter befinden sich 18 Gene, die dem nachweislich keimungsrelevanten Ca2+/Phosphoinositid-Signalsystem und cAMP/PKA-Signaltransduktionsweg sowie der für die Keimung vermutlich essentiellen Transkription oder Proteinsynthese zugeordnet werden können. Des weiteren wurden Gene identifiziert, denen Bedeutung im zellulären Metabolismus und Transport, bei der Sporenadhäsion und zellulären Kommunikation sowie bei der Zellteilung und Stressabwehr zu kommt. Neue ’target’-orientierte Verfahren erlauben eine im Vergleich zu den etablierten auf Massenscreenings basierenden Methoden eine schnellere und zielgerichtetere Entwicklung von neuen fungiziden Wirkstoffen. Verschiedene im Rahmen dieser Arbeit identifizierte und charakterisierte Gene stellen aufgrund teilweise hoher Sequenzspezifität für pilzliche Organismen und möglicher Essentialität bei der Sporenkeimung vielversprechende Ansatzstellen für ein ’target’-orientiertes Fungiziddesign dar.     «

Der Entwicklung von Fungiziden mit neuen Ansatzstellen und Wirkmechanismen hat aufgrund stetiger Resistenzbildung gegen landwirtschaftlich genutzte Fungizide eine herausragende Bedeutung für die Sicherung einer auch zukünftig hochproduktiven und -qualitativen Pflanzenproduktion. Insbesondere durch Fungizidmaßnahmen während früher Infektionsstadien kann ein nachhaltiger Schutz der Nutzpflanze erreicht werden. Unter Verwendung der cDNA-AFLP-Methode sowie durch Einsatz der SSH Technik konnten insge...     »

Due to occurrence of resistance to agriculturally used fungicides there is a permanent need for development of new fungicidal agents to guarantee a high productive and high qualitative crop production in the future. The aim of this work was to isolate genes which are up regulated during fungal spore germination for further use as targets in target-specific development of new antifungal agents. Two PCR-based differential screening techniques, cDNA amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP) and suppression subtractive hybridisation (SSH), were successfully applied to clone 50 and 47 cDNA copies with up regulated expression during spore germination in the plant pathogens Phytophthora infestans and Pyrenophora teres respectively. 14 cDNA clones were further analysed by real time RT-PCR. The normalisation of differentially expressed transcripts was done with 18S rRNA sequence, which has proven to be a suitable standard for normalisation in quantitative gene expression studies on germinating fungal spores. All transcripts showed a significant increase of expression during spore germination, confirming the reliability of the cDNA-AFLP and SSH results. Sequence analysis with 97 cDNA clones revealed 35 unique sequences with significant similarity to database entries. 18 sequences showed homology to genes which are essential in spore germination, including genes of the Ca2+/phosphoinositide signalling system and the cAMP/PKA signal transduction pathway, as well as genes involved in transcription and protein biosynthesis. The remaining genes have predicted functions in cellular metabolism, cellular transport, cellular communication, cell division, spore adhesion, and stress defence. New target-specific methods allow a more rapid and specific development of new antifungal agents compared to conventional on high throughput screenings based methods. Due to high sequence specificity to fungal organisms and potential essentiality in fungal spore germination several of the identified and characterised genes represent promising candidates in a target-specific fungicide design.     «

Due to occurrence of resistance to agriculturally used fungicides there is a permanent need for development of new fungicidal agents to guarantee a high productive and high qualitative crop production in the future. The aim of this work was to isolate genes which are up regulated during fungal spore germination for further use as targets in target-specific development of new antifungal agents. Two PCR-based differential screening techniques, cDNA amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP)...     »