The applicability of proteomics to investigate differences in the plant proteome due to genetic engineering was explored using Arabidopsis (A.) thaliana as a model organism. Differences in the proteome were evaluated in the context of natural variability. A proteomics method, based on two-dimensional gel electrophoresis (2DE), was established for the qualitative and quantitative analysis of the seed proteome of A. thaliana and validated for repeatability, sensitivity, and linearity. The developed 2DE method resolves proteins with isoelectric points between 4 and 9 and molecular weights of 6 to 120 kD and is sensitive enough to detect protein levels in the low nanogram range. Using this method, it has been possible to resolve and compare spot positions and quantities of > 700 protein spots on midsize gels. The linear relationship between protein amount and spot quantity was demonstrated for two spiked protein standards and 20 endogenous seed proteins representing a wide range of pIs, Mws, and concentrations. The protein pattern repeatability was found to be high and three replicate gels were sufficient to investigate a threefold difference in spot quantity for most resolved spots (~96%) and a twofold difference for the majority (~72%) of resolved spots. The understanding of the natural variability of the proteome is crucial for the interpretation of biological and safety-relevant differences between transgenic and non-transgenic parental lines. Thus, the natural variation of protein profiles within the A. thaliana ecotype Columbia (Col-0) and among a set of A. thaliana ecotypes was determined by utilizing the validated 2DE method. The seed protein pattern within the ecotype Col-0 was rather constant. However, differences in spot quantity were observed between seed protein profiles of individual plants of Col-0 grown side-by-side or in two different growth chambers with the same settings. The data indicates the potential of small environmental changes on the seed proteome and highlights the sensitivity of the optimized 2DE method to detect such differences. In addition, it was shown that storage also impacted the seed proteome. The natural variability of seed protein profiles resulting from different genetic backgrounds was found to be extensive among a set of twelve A. thaliana ecotypes. Almost half of the resolved spots varied with respect of their presence/absence and one quarter of the spots, present in all ecotypes, varied in spot quantity (3- to 53-fold). These data have been used to ascertain the biological and genetic variation in protein profiles within and between A. thaliana ecotypes and as baseline a for the head-to-head comparison of transgenic versus non-transgenic Arabidopsis lines in order to assess differences in the context of natural variability. The 2DE method was applied to the comparison of transgenic versus non-transgenic Arabidopsis lines. Insertional and pleiotropic effects on the proteome due to genetic engineering were investigated using twelve transgenic A. thaliana lines containing an inserted b-glucuronidase (gus) gene, an overexpressed p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (hppd) gene, or an overexpressed g-tocopherol-methyltransferase (gtmt) gene. These lines were chosen as they present two different strategies: (i) a transgene (gus) that has no impact on an endogenous metabolic pathway and (ii) transgenes (hppd and gtmt) that have impact on an endogenous metabolic pathway (a-tocopherol biosynthesis). The genetic modification of the Arabidopsis lines using three different genes and three different promoters did not result in any phenotypic differences exceeding the natural variation other than the intended differences due to the introduction of the transgene. The same was found for the seed proteome. The process of transformation did not cause insertional or pleiotropic changes to the analyzed seed proteome. Differences in spot quantity between transgenic and non-transgenic lines fell in the range of natural variation or were part of the intended effect. This work demonstrated that 2DE can be utilized to reliably analyze the seed proteome of A. thaliana. During the course of the study, it became evident that a critical data analysis needs to take into consideration the analytical and the natural variability of the proteome. The latter is essential for the evaluation of potential insertional and pleiotropic effects in comparing transgenic and non-transgenic plants. Thus, a proteome analysis should comprise the following steps: (i) method validation, (ii) generation of baseline data for the natural variation, and (iii) head-to-head comparison between transgenic and non-transgenic plants in the context of the established analytical and natural variation. The proteomics approach described for A. thaliana promises to be useful for the analysis of the proteome in other plant species including crop plants in order to investigate effects due to genetic engineering.     «

The applicability of proteomics to investigate differences in the plant proteome due to genetic engineering was explored using Arabidopsis (A.) thaliana as a model organism. Differences in the proteome were evaluated in the context of natural variability. A proteomics method, based on two-dimensional gel electrophoresis (2DE), was established for the qualitative and quantitative analysis of the seed proteome of A. thaliana and validated for repeatability, sensitivity, and linearity. The develope...     »

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung von Proteomik zur Untersuchung von Auswirkungen gentechnischer Verfahren auf Pflanzenproteome überprüft. Als Modell-organismus wurde Arabidopsis thaliana gewählt. Veränderungen im Proteom wurden vor dem Hintergrund der natürlichen Schwankungsbreite bewertet. Zur qualitativen und quantitativen Analyse des Samenproteoms von A. thaliana wurde eine auf zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) basierende Methodik etabliert und hinsicht-lich Wiederholbarkeit, Empfindlichkeit und Linearität validiert. Mit der entwickelten 2DE-Methode war es möglich, Proteine mit isoelektrischen Punkten (pI) zwischen 4 und 9 und Molekulargewichten (Mw) von 6 bis 120 kD aufzutrennen und im Nanogramm-Bereich nachzuweisen. Auf einem Mittelformat-Gel konnten mehr als 700 Proteinspots aufgetrennt und hinsichtlich ihrer Position und Quantität verglichen werden. Der lineare Zusammenhang zwischen Proteinmenge und Spotquantität wurde am Beispiel von zwei dotierten Proteins-tandards und anhand von 20 Samenproteinen, die einen weiten Bereich an pIs, Mws und Konzentrationen abdeckten, aufgezeigt. Die Reproduzierbarkeit der Proteinmuster war sehr gut; drei Replikate waren ausreichend, um einen 3-fachen Unterschied in Spotquantität für fast alle Proteinspots (~96%) und einen 2-fachen Unterschied für die Mehrzahl (~72%) der aufgetrennten Spots zu ermitteln. Die validierte 2DE Methode wurde eingesetzt, um natürliche Schwankungen von Samenproteinprofilen für den A. thaliana Ökotyp Columbia (Col-0) und innerhalb einer Reihe von A. thaliana Ökotypen zu bestimmen. Trotz standardisierter Umweltbedingungen konnten Unterschiede in den Spotquantitäten individueller Col-0 Pflanzen beobachtet werden. Das qualitative Samenproteinmuster war innerhalb individueller Pflanzen des Ökotypes Col-0 relativ konstant. Die Daten zeigen das Einflusspotential schon geringer Änderungen in den Umweltbedingungen auf das Samenproteom und verdeutlichen die Nachweisempfindlichkeit der optimierten 2DE-Methode. Auch die Lagerung der geernteten Samen beeinflusste das Samenproteom und führte zu Änderungen in der Quantität von Proteinspots. Für die zwölf untersuchten A. thaliana Ökotypen erwies sich die aus den unterschiedlichen genetischen Hintergründen resultierende natürliche Schwankungsbreite der Samenproteinprofile als bemerkenswert groß. Fast die Hälfte der aufgelösten Spots variierten hinsichtlich An-/Abwesenheit und 25% der Spots, die in allen Ökotypen anwesend waren, variierten in Spotquantität (3- bis 53-fach). Die ermittelten Schwankungsbreiten des Proteinprofils innerhalb und zwischen A. thaliana Ökotypen wurden als Grundlage herangezogen, um die in einem direkten Vergleich von transgenen und nicht-transgenen Arabidopsis-Linien ermittelten Unterschiede hinsichtlich ihrer biologischen Relevanz zu beurteilen. Mit Hilfe der 2DE-Methode wurde aus den gen-technischen Veränderungen möglicherweise resultierende Insertionseffekte oder pleiotrope Effekte in zwölf transgenen A. thaliana Linien, die entweder ein neu eingefügtes β-Glucuronidase (gus) Gen, ein überexprimiertes p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (hppd) Gen oder ein überexprimiertes γ-Tocopherol-methyltransferase (gtmt) Gen enthielten, untersucht. Diese Linien wurden ausgewählt, da sie zwei unterschiedliche Strategien repräsentieren: (i) ein Transgen (gus), das keinen Einfluss auf einen endogenen Stoffwechselweg hat und (ii) Transgene (hppd und gtmt), die einen Einfluss auf einen endogenen Stoffwechselweg (a-Tocopherol-Biosynthese) haben. Die gentechnisch veränderten Arabidopsis-Linien zeigten keine Veränderungen im Phänotyp, die über die natürlichen Schwankungen hinausgingen. Auch die durch Proteomanalytik aufgezeigten Unterschiede in Spotquantitäten zwischen transgenen und nicht-transgenen Linien lagen im Rahmen der natürlichen Schwankungsbreiten oder waren das Ergebnis der beabsichtigten Veränderungen. Die erarbeiteten Daten zeigen, dass 2DE eine zuverlässige Methode zur Untersuchung des Samenproteoms von A. thaliana darstellt. Es wurde deutlich, dass für eine kritische Datenanalyse und eine Beurteilung möglicher Insertionseffekte oder pleiotroper Effekte die Berücksichtigung der analytischen und natürlichen Schwankungsbreite des Proteoms essentiell ist. Eine Proteomuntersuchung sollte daher folgende Schritte beinhalten: (i) Methodenvalidierung, (ii) Erarbeitung von Basisdaten zu natürlichen Schwankungsbreiten, und (iii) direkter Vergleich von transgenen und nicht-transgenen Pflanzen unter Berücksichtigung der etablierten analytischen und natürlichen Schwankungsbreiten. Die hier zur Analyse des Proteoms von A. thaliana vorgestellte Methode verspricht auch zur Untersuchung möglicher Auswirkungen gentechnischer Verfahren auf das Proteom anderer Pflanzen, z. B. Nutzpflanzen, anwendbar zu sein.     «

In der vorliegenden Arbeit wurde die Eignung von Proteomik zur Untersuchung von Auswirkungen gentechnischer Verfahren auf Pflanzenproteome überprüft. Als Modell-organismus wurde Arabidopsis thaliana gewählt. Veränderungen im Proteom wurden vor dem Hintergrund der natürlichen Schwankungsbreite bewertet. Zur qualitativen und quantitativen Analyse des Samenproteoms von A. thaliana wurde eine auf zweidimensionaler Gelelektrophorese (2DE) basierende Methodik etabliert und hinsicht-lich Wiederholbarke...     »