Axone werden im ZNS von Wirbeltieren durch das Neuronale Inhibitorprotein Nogo-A aktiv am Aussprossen gehindert. Dies beschränkt die Plastizität des adulten ZNS, verhindert allerdings im Fall einer Läsion auch maßgeblich die neuronale Regeneration. Der mono-klonale Antikörper IN-1 (IgM/k) neutralisiert die inhibitorische Wirkung von Nogo-A und ermöglicht so die axonale Regeneration im ZNS. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zur Herstellung und Optimierung rekombinanter Fragmente des Antikörpers IN-1 sowie des neuronalen Inhibitors Nogo-A mittels Protein-Engineering einschließlich der Analyse ihrer Wechselwirkung entwickelt. Auf diese Weise wurden schließlich in vitro – im Gegensatz zu konventionellen Immunisierungsversuchen – Antikörper mit verbesserter Affinität und neutralisierender Aktivität erhalten. Für den IN-1 Antikörper wurde zunächst die bakterielle Produktion eines chimären Fab-Fragmentes im Fermenter-Maßstab soweit verbessert, daß es in ausreichender Menge für Zellkultur- und Tierexperimente zur Verfügung stand. Hierzu wurde eine vektorvermittelte Komplementierung der chromosomalen proBA-Deletion des prolin-auxotrophen E. coli K12-Stamms JM83 realisiert. Diese ermöglichte die Nutzung des überlegenen Sekretionsverhaltens von JM83 bei der Fermentation in einem Minimalmedium und führte zur Stabilisierung des Expressionsvektors durch den zusätzlichen metabolischen Selektionsdruck. Das chimäre IN-1 Fab-Fragment, dessen Ausbeute mit diesem Verfahren im Vergleich zu vorherigen Experimenten vervierfacht wurde, wurde mittels IMAC gereinigt und für Regenerations-Experimente verwendet. Im Zusammenhang mit der Behandlung von Rückenmarksläsionen bei Ratten konnte mit dem IN-1 Fab-Fragment eine signifikante Regeneration von verletzten zentralnervösen Neuronen erreicht werden. Auf der Grundlage des rekombinanten Wildtyp IN-1 Fab-Fragments wurde zudem die Reini-gung mittels der Thiophilen Adsorptionschromatographie etabliert. Dabei wurde das Fab-Fragment unabhängig von einem Affinitätsanhängsel (His6- oder Strep-Tag) in einem Schritt als löslicher Heterodimer aus der periplasmatischen Proteinfraktion von E. coli isoliert. Insbesonders für eine eventuelle therapeutische Anwendung von optimierten Varianten des IN-1 Fab-Fragments ist der Verzicht auf Affinitätsanhängsel vorteilhaft. Die vermutlich extrazelluläre und inhibitorisch aktive Domäne von Nogo-A wurde als lösliches Protein in E. coli hergestellt und durch Streptavidin-Affinitätschromatographie gereinigt. Das erhaltene Fragment NiFr2 war inhibitorisch aktiv und bildete die Grundlage für die In vitro-Affinitätsmaturierung des Antikörpers IN-1. Durch Herstellung eines rekombinanten Nogo-A Fragments (NiFr4) mit einem Strep-Tag sowie einem His6-Tag an den beiden Termini, welches durch IMAC und Streptavidin-Affinitätschromatographie gereinigt wurde, konnten Reinheit und Homogenität der Präparationen im Vergleich zu NiFr2 maßgeblich verbessert werden. Dies war die Grundlage für den erstmaligen Nachweis der Antigen/Antikörper-Komplexbildung aus Nogo-A und dem IN-1 Fab-Fragment mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie. Bis zu Beginn der vorliegenden Arbeit war es aufgrund der geringen Affinität von IN-1 gegenüber dem vermuteten Antigen nicht gelungen, die direkte Bindung des Antikörpers an natives oder rekombinantes Nogo-A mit immunchemischen Methoden nachzuweisen und damit auf molekularer Ebene zu begründen. Ausgehend von dem IN-1 Fab-Fragment wurde daher ein Verfahren zur Affinitätsmaturierung bezüglich Nogo-A etabliert. Durch wiederholte Zyklen von ortsgerichteter Zufallsmutagenese und Durchmusterung der resultierenden Molekülbibliothek mit Hilfe eines Filterstapel-Tests auf verbesserte Bindung von NiFr2 wurde die Mutante II.1.8 des IN-1 Fab-Fragments erhalten. Das II.1.8 Fab-Fragment weist im Vergleich zu IN-1 insgesamt fünf Aminosäure-Substitutionen innerhalb von CDR-L3 auf und zeigt nachweisbare Bindung an natives Nogo-A bzw. an seine bakteriell produzierten Fragmente im ELISA. Die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem II.1.8 Fab-Fragment und NiFr4 wurde durch Oberflächenplasmonresonanz-Spektroskopie mit 1 µM bestimmt. Das Wildtyp IN-1 Fab-Fragment zeigte unter denselben Bedingungen eine achtfach schlechtere Affinität. Damit wurde erstmals mit immunchemischen Methoden demonstriert, daß es sich bei dem Produkt des Nogo-A-Gens um das Antigen des Antikörpers IN-1 handelt. Im Gegensatz zum Wildtyp IN-1 wurden durch Verwendung des II.1.8 Fab-Fragments bei immunhistochemischen Experimenten myelinreiche Regionen im Hirn und Rückenmark der Ratte spezifisch angefärbt. Darüber hinaus zeigte das II.1.8 Fab-Fragment in Zellkultur-Experimenten eine konzentrationsabhängige neutralisierende Aktivität gegenüber der inhibitorischen Wirkung von Nogo-A, die deutlich über der des IN-1 Fab-Fragments lag. Damit wurde der Zusammenhang zwischen einer verbesserten proteinchemischen Bindung von Nogo-A durch das optimierte IN-1 Fab-Fragment und einer erhöhten neutralisierenden Aktivität gezeigt. Für eine mögliche therapeutische Anwendung von Nogo-A-bindenden rekombinanten Fab-Fragmenten wurden die variablen Domänen des II.1.8 Fab-Fragments humanisiert. Dazu wurden dessen CDRs auf die Gerüststruktur der variablen Domänen des humanen Anti-Thyroidperoxidase-Antikörpers TR1.9 übertragen. Das resultierende humII.1.8 Fab-Fragment wurde in E. coli produziert und mittels IMAC gereinigt. In ELISA-Experimenten wurde der Erhalt der Bindungsaktivität des humanisierten Fab-Fragments gegenüber dem rekombinanten Nogo-A Fragment NiFr2 nachgewiesen. Schließlich wurde die bakterielle Produktion von neuartigen Fusionsproteinen aus einem Fab-Fragment und dem Enzym TEM1 b-Lactamase etabliert. Deren bifunktionelle Eigenschaften im Hinblick auf die Antigenbindung und die Reporteraktivität wurden durch ELISA sowie enzymkinetische Experimente nachgewiesen. Damit wurde eine Grundlage für die Ver-wendung ähnlicher Fusionsproteine für diagnostische oder auch therapeutische Anwendungen geschaffen.     «

Axone werden im ZNS von Wirbeltieren durch das Neuronale Inhibitorprotein Nogo-A aktiv am Aussprossen gehindert. Dies beschränkt die Plastizität des adulten ZNS, verhindert allerdings im Fall einer Läsion auch maßgeblich die neuronale Regeneration. Der mono-klonale Antikörper IN-1 (IgM/k) neutralisiert die inhibitorische Wirkung von Nogo-A und ermöglicht so die axonale Regeneration im ZNS. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden zur Herstellung und Optimierung rekombinanter Fragmente des Anti...     »

The outgrowth of axons in the CNS of higher vertebrates is strongly restricted by the neuronal inhibitor protein Nogo-A leading to limited plasticity and the lack of neuronal regeneration after lesions. The inhibitory activity of Nogo-A can be neutralized by application of the monoclonal antibody IN-1 (IgM/k) which enables neuronal outgrowth and regeneration in the CNS. In this work the production and optimization of recombinant fragments of IN-1 and Nogo-A is described including the detection and analysis of their interaction in vitro. In contrast to conventional immunization experiments by the approach realized in this work it was possible to obtain antibodies with improved affinity and neutralizing activity. In a first step the high-scale production of a partially humanized (chimeric) IN-1 Fab-fragment was optimised allowing cell culture and in vivo experiments. Therefore the proline-auxotrophic Escherichia coli K12 strain JM83 harboring a newly constructed expression vector providing the proBA gene in trans was utilized for the production of the IN-1 Fab-fragment in a fermentor. The plasmid mediated complementation of the chromosomal proBA deletion abolished plasmid-loss observed in earlier experiments and enabled the utilization of JM83 as an expression strain with approved periplasmic protein secretion characteristics in the presence of minimal media. Using this strategy the yield of the chimeric IN-1 Fab-fragment could be improved by the factor of four. The obtained Fab-fragment was used for experiments in vivo and led to a significant regeneration of injured neurons in the spinal cord of adult rats. Furthermore, based on the chimeric IN-1 Fab-fragment an alternative purification procedure utilizing thiophilic adsorption chromatography (TAC) was established. By this way the Fab-fragment was isolated in one step from the periplasmic protein fraction of E. coli without the need for an affinity tag (e. g. His6- or Strep-Tag). This method should prove valuable in case of a therapeutic application of the IN-1 Fab-fragment when the presence of affinity tags might not be feasible. The putative extracellular domain of Nogo-A which is thought to carry its inhibitory activity was produced as a soluble protein in E. coli and purified by Streptavidin (SA) affinity chromatography. The obtained fragment NiFr2 revealed inhibitory activity and was used for in vitro affinity maturation of the antibody IN-1. In order to improve purity and homogeneity of the target protein a recombinant Nogo-A fragment (NiFr4) which carried a His6 tag in addition to the Strep-Tag was produced and purified by consecutive IMAC and SA affinity chromatography. Using NiFr4 in surface plasmon resonance spectroscopy it was possible to detect and analyze the formation of the antigen/antibody complex of Nogo-A and IN-1 for the first time. Due to the low antigen affinity of the IN-1 antibody it had not been possible to detect its binding to native or recombinant Nogo-A by conventional immunoassays until the begin of this work. Therefore a method for an in vitro affinity maturation concerning Nogo-A was established starting from the chimeric IN-1 Fab-fragment. After repeated cycles of site-directed random mutagenesis and screening the mutant II.1.8 of the IN-1 Fab-fragment was obtained carrying five side chain substitutions within CDR-L3 and showing detectable binding to native and recombinant Nogo-A in ELISA experiments. The dissociation constant for the complex with NiFr4 was determined in surface plasmon resonance measurements as approximately 1 µM. The affinity of the non-mutated IN-1 Fab-fragment was 8-fold lower. This proved for the first time that Nogo-A represents the antigen of the antibody IN-1. In contrast to the IN-1 Fab-fragment the engineered Fab-fragment appeared to be well suited for the specific detection of Nogo-A in immunochemical assays and for the histochemical staining of myelin-rich tissue sections. Most importantly, its concentration-dependent neutralizing effect on the Nogo-A inhibitory activity was significantly enhanced in cell culture. These experiments revealed the coherence between improved binding affinity to Nogo-A and the enhanced biological activity in the context of inhibitor neutralization in the CNS. As a further step to the therapeutic application of Nogo-A binding recombinant Fab-fragments in near future the variable domains of the II.1.8 Fab-fragment were humanized by CDR-grafting. The resulting humII.1.8 Fab-fragment was produced in E. coli, purified by IMAC and showed a detectable binding to recombinant Nogo-A fragments in ELISA. Finally, the bacterial production of fusion proteins constituted of an Fab-fragment and the enzyme TEM1 b-lactamase was established. The (bi-)functionality of this construct concerning antigen-binding and reporter activity was proven by ELISA and enzyme kinetic experiments. This new type of fusion proteins might serve as diagnostic or therapeutic tools in the future.     «

The outgrowth of axons in the CNS of higher vertebrates is strongly restricted by the neuronal inhibitor protein Nogo-A leading to limited plasticity and the lack of neuronal regeneration after lesions. The inhibitory activity of Nogo-A can be neutralized by application of the monoclonal antibody IN-1 (IgM/k) which enables neuronal outgrowth and regeneration in the CNS. In this work the production and optimization of recombinant fragments of IN-1 and Nogo-A is described including the detection a...     »