Holins are small hydrophobic proteins causing non-specific membrane lesions at the end of bacteriophage multiplication, to promote access of the murein hydrolase to their substrate. We have established a lambda-delta-Sthf genetic system, which enables functional expression of holins from various phages in an isogenic phage lambda background, and allows qualitative evaluation of their ability to support lysis of Escherichia coli cells. Synthesis of holins is under control of native lambda transcription and translation initiation signals, and the temperature-sensitive CIts857 repressor. A number of different holins were tested in this study. The opposing action of phage lambda S105 and S107 holin variants in lysis timing could be confirmed, whereas we found evidence for a functionally non-homologous dual translational start motif in the Listeria phage Hol500 holin. The largest holin known, HolTW from a Staphylococcus aureus phage, revealed an early lysis phenotype in the lDSthf background, which conferred a plaque forming defect due to premature lysis. Mutant analysis revealed that an altered C-terminus and/or a V52L substitution were sufficient to delay lysis and enable plaque formation. These results suggest that the extensively charged HolTW C-teminus may be important in regulation of lysis timing. Gene 17.5 product of E. coli phage T7, and Gp T from T4 was found to support sudden, saltatory cell lysis in the lDSthf background, which clearly confirms their holin character. In conclusion, lDSthf offers a useful genetic tool for studying the structure-function relationship of the extremely heterogeneous group of holin protein orthologs. MscL, the mechanosensitive channel forming protein, which shares main structural features with holins of was unable to complement the lysis defect of lDSthf, confirming specitivity of holin function. The functional properties of Hol118 holin from Listeria monocytogenes bacteriophage A118 were analysed in detail. The gene was cloned into lDSthf, whose CIts857 repressor allows precise estimation of the cell lysis event mediated by a cloned holin, through the possibility to heat-induce the lytic cycle in lysogenized E. coli. Native hol118 caused relatively late cell lysis, beginning at 90 min after induction. Lysis could not be prematurely triggered with energy poisons, indicating that the energized membrane does not inhibit permeabilization by this holin. Immunological analyses demonstrated that Hol118 appears in the inner membrane fraction of infected cells 20 min after phage multiplication starts in induced E. coli. Hol118 could also be detected in A118-infected Listeria monocytogenes cells. Since hol118 features a dual start, different N-terminally modified Hol118 variants were tested for differences in lytic properties. Changing the ATGs encoding M1 or M4 into CTG had no significant influence on lysis timing, indicating that these alleles do not assume the effector/inhibitor roles described for S. Toeprinting assays of hol118 mRNA revealed use of an additional ATG start codon at position 40, encoding M14. Using in vitro approaches, we were able to demonstrate that a Hol118(83) variant is actually translated from the hol118 transcripts. This N-terminally truncated holin lacks the first predicted transmembrane domain. Although it appears in the cytoplasma membrane, it is functionally deficient and unable to complement R in lDSthf. Changing the M14-encoding ATG into codons not used as translational starts (M14I, M14L) resulted in an accelerated, premature lysis phenomenon, pointing to an inhibitor function of Hol118(83). This hypothesis was further supported by the observation that hol118(83) expressed in trans also inhibited holin function. This suggests that the first transmembrane domain is indispensable for the permeablization process leading to pore formation. Based on our findings, we propose a new model of holin functional regulation, where the intragenic Hol118(83) acts as an functional inhibitor, and therefore constitutes a key part of the lysis clock of A118. The strict regulation and inhibition of poreforming aids to explain the long latend period of Listeria phage A118, where the onset of lysis under optimal conditions takes approximately 70 min, more than twice the time needed by phage l. The functional properties of Hol500 holin from Listeria monocytogenes bacteriophage A500 was also analysed, and compared to Hol118 and to Hol2438 from Listeria innocua. Native hol500 caused cell lysis, beginning at 60 min after induction of lDSthf::hol500. Here, lysis could be prematurely triggered with energy poisons, indicating that the energized membrane inhibits permeabilization by this holin. N-terminally modified Hol500 variants were tested for differences in lytic properties. Changing M14-encoding ATG into ATT resulted in accelerated cell lysis. Toeprinting assays on hol500 mRNA revealed use of M14 as a translational start pointing to the synthesis of a truncated protein from this position. We have shown that Hol118(83), the intragenic inhibitor of Hol118, can also inhibit Hol500 lysis, which further supports our model for regulation of lysis timing in these very similar Listeria holins. Hol2438 differs from Hol500 in the reduced net charge of the C-terminal domain, due to the lack of one lysine residue at the C-terminal end. This difference had a significant influence on lysis timing, confirming the crucial role for the distal part of the C-terminus of Listeria holins tested in this work.     «

Holins are small hydrophobic proteins causing non-specific membrane lesions at the end of bacteriophage multiplication, to promote access of the murein hydrolase to their substrate. We have established a lambda-delta-Sthf genetic system, which enables functional expression of holins from various phages in an isogenic phage lambda background, and allows qualitative evaluation of their ability to support lysis of Escherichia coli cells. Synthesis of holins is under control of native lambda transcr...     »

In dieser Arbeit wurde die Struktur-Funktionsbeziehung von Holinen, phagencodierten Membranproteinen in einem einheitlichem genetischen Hintergrund untersucht. Für den zeitlichen Verlauf und die effektive intrazelluläre Lyse von phageninfizierten Bakterien ist außer den Endolysinen als Mureinhydrolasen meist noch ein zusätzliches Protein nötig, welches über Porenbildung in der Cytoplasma-Membran den Durchtritt der Endolysine an das Zellwand-Substrat ermöglicht. Diese kleinen hydrophoben Proteine werden aufgrund ihrer Funktion als Holine bezeichnet. Die Primär-Sequenzen der Holinen sind sehr heterogen; es gibt fast keine signifikanten Homologien, außer bei einzelnen Phagen von taxonomisch sehr nah verwandten Bakterien. Hier wurde ein Derivat von dem Phagen Lambda-gt11 konstruiert, Lambda-delta-Sthf, in dem das S Holin Gen vollständig deletiert wurde und eine eingeführte EcoRI - Schittstelle die Einklonierung einen heterologen Holin Gens erlaubte. Die Lysisgen-Kassette mit dem klonierten Holin Gen konnte mittels Prophagen-Induktion von lDSthf durch Inaktivierung des temperatur-sensitiven Cits857 Repressors exprimiert werden. Beobachtung und Verlauf des zeitlichen Verlaufes der Lyse ermöglichte einen Vergleich der Funktion verschiedener Holine. Als erstes wurden die in der Funktion unterschiedliche Varianten von Lambda S getestet. Die Expression des S105 Effektors führte zu sehr schneller, vorzeitiger Lyse, während der Inhibitor S107 deutlich schlechter lysierte. Das größte bis jetzt bekannte Holin des Staphylococcus aureus Phagen Twort verursachte eine vorzeitige Lyse die zu einem "Plaque Defekt" führte. Die Holine der virulenten E. coli Phagen T4 (gp T) und T7 (gp 17,5) führten zu einer schnellen, abrupten Lyse, die für diese in ihrer Struktur sehr unterschiedlichen Holinen fast identisch war. Außerdem wurde gezeigt das ein porenbildendes Membranprotein, MscL, welches den Holinen gemeinsame Sekundär-Strukturmerkmalen aufweist, in lDSthf keine Lyse verursachte. Das bedeutet, das die Funktion auch bei der extermen Heterogenität der primären Holinstrukturen spezifisch ist. Die membranpermeabilisierende Aktivität des Hol118 Holin des Listeria monocytogenes Bakteriophagen A118 wurde in lDSthf getestet. lDSthf::hol118 lysierte E. coli Zellen relativ spät, 90 min nach Induktion. Die Lyse konnte auch nicht durch eine Zerstörung des Membranpotentials vorzeitig induziert werden. Zwanzig Minuten nach der lDSthf::hol118 Prophagen-Induktion war Hol118 in der inneren Membranfraktion von E. coli immunologisch nachweisbar. Außerdem wurde das Hol118 Protein in der Membran der Listeria Zellen nach A118 Infektion nachgewiesen. Um den potentiellen doppelten Start zu untersuchen, wurden Mutationen im N-Terminus eingeführt und der Effekt dieser Mutationen getestet. Veränderungen des ersten und vierten ATGs hatten keinen bedeutenden Einfluß auf den zeitlichen Verlauf der Lyse. "Toeprinting" auf der hol118 mRNS zeigte ein zusätzliches ATG Start Kodon an Nukleotid-Position 40 in hol118. In vitro Versuche zeigten daß diese Hol118(83) Variante von hol118 tatsächlich translatiert wird. Das gekürzte Protein kann nur zwei Transmembrandomänen in der Membran bilden, ist nicht mehr funktionsfähig und kann R in lDSthf nicht mehr komplementieren. Diese funktionellen Eigenschaften von Hol118(83) zeigten eindeutig das die erste Transmembrandomäne für die porenbildende Funktion des Holin essentiell ist. Ersatz des M14 ATG Kodons in die für die Initiation der Translation in der Regel nicht verwendeten CTG or ATT (M14L, M14I) führte zu zunehmend schnelleren Lyse. Diese Ergebnisse deuten auf eine Inhibitor-Funktion für Hol118(83) hin. Hol118(83) inhibierte auch in trans Hol118 induzierte Lyse. Auf Grund dieser Ergebnisse wird ein neues Modell postuliert: Hol118(83), das an Nukleotid-Position 40 des hol118 Gens startet funktioniert als der Inhibitor der Lyse, und hat somit einen Einfluß auf die Regulation der Dauer der Latenzphase des A118 Bakteriophagen. Die Aminosäuresequenzen der Holine Hol118 und Hol500 unterscheiden sich nur in sieben Aminosäuren, haben aber unterschiedliche membranpermeabilisierende Aktivitäten in lDSthf. lDSthf::hol500 lysierte die E. coli Zellen schneller und effizienter als Hol118. Das Membranpotential der Zelle hatte hier einen inhibitorischen Effekt auf die Lyse; die Inaktivierung des Membranpotentials führte zu einer vorzeitigen Lyse. Wie bei Hol118 wurden Mutationen in den N-Terminus eingeführt und getestet. Die Änderungen des vierten Methionins in Leucin oder Isoleucin verstärkten die lytische Aktivität, während die Inaktivierung des ersten ATGs zu einer verzögerten Lyse führte. "Toeprinting" auf der hol500 mRNS zeigte ebenfalls ein zusätzliches intragenes ATG Start Kodon an Position 40. Die Änderung ATG zu ATT hatte einen identischen funktionellen Effekt wie in hol118: Beschleunigung der Lyse. Exprimiert in trans inhibierte Hol118(83) die Hol500-induzierte Lyse. Da die Unterschiede in der Aminosäuresequenzen zwischen Hol118 und Hol500 minimal sind kann das postulierte Modell der Lyseinhibition für A118 auf den Phagen A500 erweitert werden. Hol2438 unterscheidet sich von Hol500 nur in einer Aminosäure des C-terminalen Bereichs. Das fehlende Lysin reduzierte die positive Ladung des C-Terminus was im Vergleich zu Hol500 zu einer Beschleunigung der Lyse führte.     «

In dieser Arbeit wurde die Struktur-Funktionsbeziehung von Holinen, phagencodierten Membranproteinen in einem einheitlichem genetischen Hintergrund untersucht. Für den zeitlichen Verlauf und die effektive intrazelluläre Lyse von phageninfizierten Bakterien ist außer den Endolysinen als Mureinhydrolasen meist noch ein zusätzliches Protein nötig, welches über Porenbildung in der Cytoplasma-Membran den Durchtritt der Endolysine an das Zellwand-Substrat ermöglicht. Diese kleinen hydrophoben Proteine...     »