Die Peptidtransporter PEPT1 und PEPT2 in Säugetieren besitzen eine wesentliche Rolle in der Aufnahme und Konservierung von Aminosäuren in verschiedenen Geweben und verfügen damit über eine nutritive Funktion. Da sie neben ihren physiologischen Substraten, Di- und Tripeptiden, auch verschiedene pharmakologisch wirksame Peptidmimetika als Substrate akzeptieren, besitzen sie darüber hinaus auch eine pharmakologische Bedeutung. Als Testsystem zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung tierischer und menschlicher Peptidtransporter konnte in dieser Arbeit die methylotrophe Hefe Pichia pastoris etabliert werden. Für den humanen intestinalen Peptidtransporter (hPEPT1) wurde gezeigt, dass eine hohe funktionelle Expressionsrate u.a. abhängig ist vom 5´-nichtranslatierten Bereich der cDNA, der Anzahl der ins Genom integrierten cDNA-Kopien und der Art des Promotors. Für das heterolog exprimierte hPEPT1-Protein mit einem Anteil von ca. 0,6% der Membranproteine in P. pastoris waren die entscheidenden funktionellen Eigenschaften wie die pH-Abhängigkeit des Transportes, die Substratspezifität und die Substrataffinität vollständig erhalten. Mittels einer Zufallsmutagenese mit nachfolgender Phänotypisierung wurden mit Ile-382 und Gly-476 zwei Aminosäurereste im hPEPT1-Protein identifiziert, deren Austausch zu einer veränderten pH-Abhängigkeit der Transportfunktion führt. Die heterologe Expression in P. pastoris erlaubte die Etablierung eines Screeningsystems für umfassende Untersuchungen zu Struktur-Affinitätsbeziehungen von Substraten für ihre Wechselwirkung mit PEPT1 und PEPT2. In Kombination mit elektrophysiologischen Untersuchungen an X. laevis Oozyten, die PEPT1 oder PEPT2 exprimieren, wurden dabei neue Einblicke in die Funktion der Carrierproteine erhalten. Unter Verwendung einer Vielzahl von Dipeptiden und Derivaten gelang es, wesentliche strukturelle Eigenschaften der Substrate festzulegen, die ihre Affinität zu den Transportern und ihre Transportfähigkeit bestimmen, wie Hydrophobizität, Ladung oder Stereoisomerie von Dipeptiden. Insbesondere konnten erstmals die minimalen strukturellen Anforderungen für die Substraterkennung und den Transport von Substraten durch PEPT2 identifiziert werden. Mit Lys[Z(NO2)]-enthaltenden Dipeptidabkömmlingen wurden die ersten spezifischen Inhibitoren der Peptidtransporter erhalten, die mit hoher Affinität (10 µM bei PEPT1 bzw. 40 nM bei PEPT2) und reversibel sowohl mit der äußeren als auch der inneren Substratbindungsstelle der Proteine interagieren. Die Hefe P. pastoris erwies sich somit hervorragend zur Expression und Charakterisierung der Peptidtransporter aus Säugern geeignet. Mit diesem System wurden wesentliche neue Erkenntnisse zur Struktur und Funktionsweise dieser sowohl nutritiv als auch pharmakologisch relevanten Transportproteine gewonnen.     «

Die Peptidtransporter PEPT1 und PEPT2 in Säugetieren besitzen eine wesentliche Rolle in der Aufnahme und Konservierung von Aminosäuren in verschiedenen Geweben und verfügen damit über eine nutritive Funktion. Da sie neben ihren physiologischen Substraten, Di- und Tripeptiden, auch verschiedene pharmakologisch wirksame Peptidmimetika als Substrate akzeptieren, besitzen sie darüber hinaus auch eine pharmakologische Bedeutung. Als Testsystem zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung tie...     »

The mammalian peptide transporters PEPT1 and PEPT2 play an important role in the absorption and conservation of amino acids in different tissues and therefore possess a nutritive role. As the peptide carriers accept besides di- and tripeptides as their physiological substrates also a variety of pharmacologically active peptidomimetics as substrates they are relevant for drug delivery and metabolism. In this work, the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established as a new heterologous expression system for mammalian peptide transporters and their functional and structural characterisation. As shown for the human intestinal peptide transporter (hPEPT1), a high functional expression level depends mainly on the 5´-untranslated region of the cDNA, the copy number of the integrated cDNA´s in the yeast genome and the promoter used. For the heterologously expressed hPEPT1-protein comprising about 0.6% of the yeast membrane proteins, all the decisive functional characteristics such as pH-dependency of transport, substrate affinity and specificity were fully preserved. By a random-mutagenesis approach to study the structure-function relationships Ile-382 and Gly-476 were identified as two amino acid residues in the hPEPT1-protein, that, when exchanged for other residues, lead to an altered pH-dependence of transport function. Moreover, the yeast system was established as a screening platform allowing extensed studies on the structure-affinity relationships of substrates binding to the peptide transporters PEPT1 and PEPT2. In combination with electrophysiological measurements in X. laevis oocytes expressing PEPT1 or PEPT2 new insights into the function and operational mode of the carriers were obtained. By using a variety of dipeptides and derivatives it was shown that different factors as hydrophobicity, charge or stereoisomerism of amino acids in dipeptides affect affinity and transport. In addition, by applying novel amino acid and dipeptide derivatives, important functional groups within the substrates and their spatial position were identified that represent the minimal structural determinants for substrate binding and transport by PEPT2. With the Lys[Z(NO2)]-dipeptide derivatives the first specific inhibitors of the peptide transporters were obtained, that interact with high affinity (10 µM in case of PEPT1 and 40 nM in case of PEPT2) and reversible mode of action at the external as well as internal substrate binding domain. In summary, the yeast P. pastoris was shown to be suitable for expression and characterisation of mammalian peptide transporters. By using this new yeast system valuable informations on structure and function of these nutritionally as well as pharmacologically important transport proteins were obtained.     «

The mammalian peptide transporters PEPT1 and PEPT2 play an important role in the absorption and conservation of amino acids in different tissues and therefore possess a nutritive role. As the peptide carriers accept besides di- and tripeptides as their physiological substrates also a variety of pharmacologically active peptidomimetics as substrates they are relevant for drug delivery and metabolism. In this work, the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established as a new heterologous expr...     »