Die Peptidtransporter PEPT1 und PEPT2 in Säugetieren besitzen eine wesentliche Rolle in der Aufnahme und Konservierung von Aminosäuren in verschiedenen Geweben und verfügen damit über eine nutritive Funktion. Da sie neben ihren physiologischen Substraten, Di- und Tripeptiden, auch verschiedene pharmakologisch wirksame Peptidmimetika als Substrate akzeptieren, besitzen sie darüber hinaus auch eine pharmakologische Bedeutung. Als Testsystem zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung tierischer und menschlicher Peptidtransporter konnte in dieser Arbeit die methylotrophe Hefe Pichia pastoris etabliert werden. Für den humanen intestinalen Peptidtransporter (hPEPT1) wurde gezeigt, dass eine hohe funktionelle Expressionsrate u.a. abhängig ist vom 5´-nichtranslatierten Bereich der cDNA, der Anzahl der ins Genom integrierten cDNA-Kopien und der Art des Promotors. Für das heterolog exprimierte hPEPT1-Protein mit einem Anteil von ca. 0,6% der Membranproteine in P. pastoris waren die entscheidenden funktionellen Eigenschaften wie die pH-Abhängigkeit des Transportes, die Substratspezifität und die Substrataffinität vollständig erhalten. Mittels einer Zufallsmutagenese mit nachfolgender Phänotypisierung wurden mit Ile-382 und Gly-476 zwei Aminosäurereste im hPEPT1-Protein identifiziert, deren Austausch zu einer veränderten pH-Abhängigkeit der Transportfunktion führt. Die heterologe Expression in P. pastoris erlaubte die Etablierung eines Screeningsystems für umfassende Untersuchungen zu Struktur-Affinitätsbeziehungen von Substraten für ihre Wechselwirkung mit PEPT1 und PEPT2. In Kombination mit elektrophysiologischen Untersuchungen an X. laevis Oozyten, die PEPT1 oder PEPT2 exprimieren, wurden dabei neue Einblicke in die Funktion der Carrierproteine erhalten. Unter Verwendung einer Vielzahl von Dipeptiden und Derivaten gelang es, wesentliche strukturelle Eigenschaften der Substrate festzulegen, die ihre Affinität zu den Transportern und ihre Transportfähigkeit bestimmen, wie Hydrophobizität, Ladung oder Stereoisomerie von Dipeptiden. Insbesondere konnten erstmals die minimalen strukturellen Anforderungen für die Substraterkennung und den Transport von Substraten durch PEPT2 identifiziert werden. Mit Lys[Z(NO2)]-enthaltenden Dipeptidabkömmlingen wurden die ersten spezifischen Inhibitoren der Peptidtransporter erhalten, die mit hoher Affinität (10 µM bei PEPT1 bzw. 40 nM bei PEPT2) und reversibel sowohl mit der äußeren als auch der inneren Substratbindungsstelle der Proteine interagieren. Die Hefe P. pastoris erwies sich somit hervorragend zur Expression und Charakterisierung der Peptidtransporter aus Säugern geeignet. Mit diesem System wurden wesentliche neue Erkenntnisse zur Struktur und Funktionsweise dieser sowohl nutritiv als auch pharmakologisch relevanten Transportproteine gewonnen.
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Die Peptidtransporter PEPT1 und PEPT2 in Säugetieren besitzen eine wesentliche Rolle in der Aufnahme und Konservierung von Aminosäuren in verschiedenen Geweben und verfügen damit über eine nutritive Funktion. Da sie neben ihren physiologischen Substraten, Di- und Tripeptiden, auch verschiedene pharmakologisch wirksame Peptidmimetika als Substrate akzeptieren, besitzen sie darüber hinaus auch eine pharmakologische Bedeutung. Als Testsystem zur funktionellen und strukturellen Charakterisierung tie...
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