Transkriptionales und posttranskriptionales Profiling neuronaler muriner Primärzellen nach Frequenz- und intensitätsabhängiger elektromagnetischer Exposition
Übersetzter Titel:
Transcriptional and post transcriptional Profiling of neural murine Primary Cells after Frequency and Intensity dependent electromagnetic Exposure
Autor:
Stock, Martin T.
Jahr:
2017
Dokumenttyp:
Dissertation
Fakultät/School:
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
Betreuer:
Kühn, Ralph (Prof. Dr.)
Gutachter:
Kühn, Ralph (Prof. Dr.); Pfaffl, Michael W. (Prof. Dr.)
neural cells, magnetic stimulation, rTMS, RT-qPCR, miRNA, transcriptome
TU-Systematik:
BIO 700d
Kurzfassung:
Neuronale Zellen generieren, leiten und empfangen bioelektrische Signale und Muster, durch die Informationen via Leitungsbahnen (Dendriten, Axone) kommuniziert werden. Hierbei ist eine elektrische Einflussnahme durch elektromagnetische Exposition der leitenden Kompartimente physikalisch bedingt, die intra- und extrazelluläre Kommunikation wird verändert oder es entsteht Signalgeneration mit der Konsequenz neuronaler Genese oder Degeneration.
Die vorliegende Arbeit zeigt anhand eines Transkriptom- und miRNA-Profiling die transkriptionalen und posttranskriptionalen Gen-Regulationen neuronaler muriner Primärzellen nach frequenz- und intensitätsabhängiger elektromagnetischer Exposition und erschließt in einer integrativen Analyse die transkriptionalen und posttranskriptionalen Interaktionen sowie die damit verbundenen möglichen pathologierelevanten Zusammenhänge.
Es soll die Frage beantwortet werden, welche Gene neuronaler muriner Zellverbände durch elektromagnetische Exposition unterschiedlicher Frequenzen und Intensitäten auf welche Art und Weise regulierend beeinflusst werden. Weiterhin soll ein Profiling selektierter pathologierelevanter miRNAs erfolgen. Methodisch bieten die Verwendung der Signalanalyse auf MEAs zur elektrophysikalischen Aktivitätskontrolle sowie die Transkriptionsanalyse des Genoms zur Erfassung aller Genregulationen hierfür eine optimale Basis.
Neuronale murine Primärzellkulturen wurden nach morphologischer und elektrophysiologischer Kontrolle für die Untersuchungen der Wirkung von elektromagnetischer Befeldung mittels repetitiver Magnetstimulation verwendet. Die standardisierten Nervenzellkulturen des Frontalen Cortex embryonaler Mäusegehirne wurden unterschiedlichen Stimulationsmustern exponiert und die transkriptionale Zellantwort zunächst semiquantitativ mittels Microarrays durchgeführt, um beeinflusste Gene ohne Vorselektion zu detektieren. Anschließend wurde die Genexpressionsanalyse mit RT-qPCR-Arrays (Morbus Alzheimer und Neurodegeneration) erfasst und die Ergebnisse in Einzel-RT-qPCR selektierter Gene validiert. Ergänzend zur RNA-Expression erfolgte ein Profiling selektierter miRNAs auch unter dem Aspekt der Zielgeninaktivierung oder Aktivierung durch entsprechende miRNAs.
Grundsätzlich wurden zwei in Frequenz, Muster und Intensität differente Expositionsformen angewendet. Stimulation A beinhaltete 70 Hz und Stimulation B 30 Hz Impulswiederholfrequenz. Die Analytik der Microarrays wurde nach Befeldung durch Stimulationsmuster A und die der RT-qPCR-Arrays, der Einzelgene und der miRNAs nach Mehrfachstimulation durch Muster A und B durchgeführt.
Zur Erfassung des gesamten Transkriptoms der Maus wurden Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST-Microarrays mit 28.853 Genen verwendet. Hierbei zeigten sich 1808 Gene mit signifikanter Expression (P < 0.05, Bayes moderated t-test). Der größte Einfluss der Regulationen in beiden Richtungen durch Magnetstimulation mit Stimulationsmuster A (70 Hz) war deutlich erkennbar im Bereich der biologischen Prozesse. Gene-Enrichment-Analytik ergab hierbei mit 35% der positiv regulierenden Gene bei Stimulation A den überwiegenden Anteil. Nach Pathway-orientierter bioinformatischer Auswertung (KEGG-Pathway) zeigten sich signifikante Einflüsse der magnetischen Befeldung auf die Transkription relevanter Gene in den Pathways Morbus Alzheimer (AD), Chorea Huntington (HD), Morbus Parkinson (PD), Vaskuläre glatte Muskelkontraktion und Arachidonsäure-Metabolismus.
Die Genexpressionsanalyse mit RT-qPCR-Arrays (Alzheimer und Neurodegeneration) selektierte 16 Kandidatengene, die in Einzel-RT-qPCR validiert wurden. Weiterhin wurden 22 pathologierelevante miRNAs analysiert, bei denen vier miRNAs signifikante Expressionsänderungen für beide Stimulationsarten, drei miRNAs nur nach Stimulationsart A und fünf nur nach Stimulationsart B zeigten.
Für die hier untersuchten neuronalen Zellverbände zeigte sich, dass die sukzessive Methodik von der Zellkultivierung über die neurophysiologische (Bursts und Spikes) und zellbiologische (Morphologie) Kontrolle der Vitalitätsparameter bis hin zur Genexpressionsanalytik geeignet ist. Die Ergebnisse der Expressionsregulationen und Gen-Interaktionen bestätigen eine Beeinflussung selektierter Gene und miRNAs.
Aufgrund der elektrophysiologischen Erfahrungen auf MEAs kann zukünftig eine Vorselektion neuer Stimulationsmuster durch Variation der Frequenz, der Pausenzeiten sowie der Amplitude der Spulenstromstärke durch Analyse der elektrophysiologischen Parameter getroffen werden. Die Analyse der Genexpression in Verbindung mit der Beeinflussung neuronaler Zellverbände nach elektromagnetischer Exposition unter Anwendung der Mess- und Vergleichsmethode der Erfassung von Bursts und Spikes stellt eine aussagekräftige Analytik im Bereich der molekularen Neurobiologie dar.
Übersetzte Kurzfassung:
Neural cells generate, transmit and receive bioelectric signals and patterns communicated from the neural pathways (dendrites, axones). Hereby, an electrical influence per electromagnetic exposure of the conducting compartments is physically affected, intra- and extracellular communication is changed or it results in unintentional generation of signals of a neural genesis or degeneration.
This manuscript, based on transcription and miRNA profiling, shows the transcriptional and post-transcriptional gene regulations of neural murine primary cells after a frequency and intensity dependent electromagnetical exposure and concludes in an integrated analysis of the transcriptional and post-transcriptional interactions, as well as the therewith relevant possible pathological aspects.
To be answered is the question of which genes in a neural murine cell cluster can regulatedly be influenced in which way and matter per electromagnetical exposure of various frequencies and intensities. Furthermore, a profiling of selected pathologically relevant miRNAs is to follow. Methodically, the use of the signal analysis of MEAs for the electrophysical activity controls, as well as the transcription analysis of genomes to record all gene regulations, offers the best basis.
Primarily, after a morphological and electrophysiological inspection, murine neural cell cultures were used for the observation of the influence of electromagnetic fields per repetitive magnetic stimulation. Standardized cell cultures of the frontal cortex of embryo mice brains were subjected to various stimulation patterns and the transcriptional cell answer carried out, at first, semi-quantatively per micro arrays in order to detect influenced genes prior to preselection. Following, the gene expression analysis with RT-qPCR arrays (Morbus Alzheimer and neurodegeneration) was recorded and the results validated in Single-RT-qPCR selected genes. In addition to the RNA expression, a profiling of selected miRNAs followed, also under the aspect of target gene inactivation or activation per respective miRNAs.
Principally, two differential exposition forms were used, differentiating in frequency, pattern and intensity. Stimulation A consisted of 70 Hz and stimulation B of 30 Hz pulse repetition frequencies. The analytic of the microarrays were carried out after exposure per stimulation with pattern A and those of the RT-qPCR arrays, the single genes and the miRNAs after multiple stimulations according to patterns A and B.
For the recording of the entire mouse transcription, the Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST microarrays with 28,853 genes were applied. Hereby, 1808 genes showed a significant expression (P<0.05, Bayes moderated t-test). The greatest regulation influence in both directions per magnetic stimulation having the stimulation pattern A (70 Hz) was significantly recognizable in the group of the biological processes. Gene Enrichment Analytic resulted in the majority portion, having 35% of the positive regulating genes per stimulation A. According to a pathway-orientated bio-informatical analysis (KEGG-pathway) significant influences of the magnetic exposure showed themselves by the transcription of relevant genes in the pathways Morbus Alzheimer (AD), Chorea Huntington (HD), Morbus Parkinson (PD), vascular smooth muscle contraction, and arachidonic acid metabolism.
The gene expression analysis with RT-qPCR arrays (Alzheimer and neuro-degeneration) selected 16 candidate genes, which were validated with the Single-RT-qPCR. Furthermore, 22 pathologically relevant miRNAs were analyzed, showing four miRNAs with significant expression modifications for both stimulation types and three miRNAs only for stimulation A and five only for stimulation B.
By these here researched neural cell clusters, it shows that the successive methods of the cell cultivation over the neuro-physiological (bursts und spikes) and cell biological (morphology) monitoring of the vitality parameters, up to the gene expression analysis, are totally suitable. The results of the expression regulations and the gene interactions confirm the capability of influencing selective genes and miRNAs.
Because of the electro-physiological experiences with MEAs, a pre-selection of new stimulation patterns per variations in frequencies, interval timing, as well as amplitudes of the coil current intensity by means of analysis of the electro-physiological parameters, can now be made. The analysis of the gene expression in connection with the influencing of neural cell clusters, after an electro-magnetic exposure, using the measuring and comparison methods for the recording of bursts and spikes, represents a meaningful analytic in the area of the molecular neurobiology.
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